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產(chǎn)品型號
品 牌GEMIG
廠商性質(zhì)其他
所 在 地上海
更新時間:2024-11-21 14:57:16瀏覽次數(shù):802次
聯(lián)系我時,請告知來自 環(huán)保在線免疫熒光五標(biāo)六色掃描全套(芯片)
服務(wù)介紹:
免疫熒光五標(biāo)即利用酪胺信號放大(TSA,Tyramide signal amplification)即TSA技術(shù),在同一張切片上對五種蛋白同時進(jìn)行標(biāo)記,從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位,定性及半定量分析。
TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上,此結(jié)合是共價結(jié)合。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合。通過微波處理,非共價結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉,而共價結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍,將靶標(biāo)通過熒光標(biāo)記顯示出來。在檢測第二個靶標(biāo)時,相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記,使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>
名稱 | 規(guī)格 |
免疫熒光五標(biāo)六色掃描全套(芯片) (包含免疫熒光染色和掃描) | 張 |
送樣運(yùn)輸要求:
1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上,常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結(jié)冰,切勿固定時間過長。
2、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸。
3、熒光四標(biāo)只能做石蠟包埋切片,不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片。
實驗大體流程:
石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。
實驗具體流程:
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。
2、抗原修復(fù):組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液(PH 6.0 檸檬酸;PH 9.0 EDTA; PH 8.0 EDTA)的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定)。
3、畫圈, 雙氧水封閉:切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈(防止試劑流走),切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min左右,封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉。
5、加第一種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
6、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。
7、加iF440-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
8、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。
9、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉。
10、加第二種一抗:在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
11、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。
12、加iF488-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
13、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。
14、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉。
15、加第三種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無菌PBS(按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
16、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。
17、加iF546-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
18、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。
19、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉。
20、加第四種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
21、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。
22、加iF594-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
23、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。
24、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉。
25、加第五種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
26、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。
27、加iF700-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
28、DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
29、自發(fā)熒光淬滅:切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,流水沖洗10min。
30、封片:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
31、鏡檢成像:切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。
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