信帆分享：網友做Western-blot成功的秘訣。信帆生物代做WB實驗，歡迎大家！

1. 提取，組織一定要切成小塊，可以用剪刀剪或刀切，剪碎后再提取，蛋白濃度能高出一倍來。

2. 研磨一定要在冰上進行，一般間斷研磨30分鐘就足夠了。

3. 離心，一般30分鐘。

4. 電泳，網上有人說膠要提前一天灌好，放一夜再用（有人說放冰箱里，有人說室溫），結果發現室溫放置后第二天上樣孔處就干了，變形不好上樣；zui關鍵的是，我發現，當天新灌的膠走出來的條帶清楚，而提前一天做的則走出來條帶模糊；所以建議大家還是當天做膠比較好。我一般是到實驗室后，把制冰機打開，大冰凍離心機打開，然后開始做膠，把分離膠灌好以后，開始提取蛋白，1小時左右開始離心了，再灌濃縮膠；這樣膠大約有一個小時的凝固時間，足夠了。 要注意的是，灌完分離膠加水的時候，要貼玻璃板的一個角加水，否則膠的局部會受到影響，影響電泳條帶筆直度。

5. 電泳緩沖液可以重復用； 做膠的試劑買分析純的一般試劑使用一點問題都沒有，不用買進口的很貴的所謂試劑； 我的蛋白分子量分別是40 和170，我分離膠用10%，濃縮用4%，一點問題都沒有，都走的很好，分的很開。

6. 轉膜，我一般電濕轉，80 V 電壓轉2小時，即使分子量170 kDa 的蛋白也能轉得過去，不用過夜的轉法，節省時間；我的40 kDa 和170 kDa 蛋白一起轉，沒有問題。

7. 封閉，我用5%奶粉，的，室溫下搖晃封閉1小時，太長了沒必要，更不一定需要過一夜。

8. 一抗，我用的是Santa的一抗，1：400稀釋（10 ul/4 ml 牛奶），用雜交袋搖晃雜交1小時，沒必要過夜；用雜交袋很省抗體；抗體不重復用；但是我當天重復用兩次，效果也還可以；雜交的時候要保持蛋白面超上。

9. 洗一抗，我是室溫下洗10 X 3次。

10. 二抗，我用1:2000，室溫雜交50分鐘，也是用雜交袋，6 ml 左右，我的膜比。

11. 再洗二抗，同前。

12. 顯色，我是把膜蛋白面朝上放在培養皿上，然后往上面滴顯色AB液，反應2-3分鐘，然后不擦干直接放暗盒里，上面蓋層保鮮膜，用筆畫出膜的邊緣，以免暗室內找不到膜的位置。

13. 洗片，我用培養皿裝顯影劑，節省啊，然后撈出后用水沖一下，再放進定影液里。

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