輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)
測(cè)定意義：
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD 是糖酵解和 TCA 循環(huán)的主要?dú)涫荏w，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的 ROS，同時(shí) NADH 再生為 NAD。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過(guò)這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD 比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD 比值說(shuō)明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過(guò)氧化狀態(tài)，NADH/NAD 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外，NAD 降解產(chǎn)物具有非常重要的調(diào)控作用。
測(cè)定原理：
NAD 和 NADH 在 254 nm 下有吸收峰，利用液相色譜法在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定其含量。
需自備的儀器和用品：
液相色譜儀、低速離心機(jī)、溶劑抽濾裝置、針頭式過(guò)濾器（水系，50 個(gè)，0.22μm）、濾膜（水系和有機(jī)系各 2 個(gè)，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可調(diào)式移液器、樣品瓶（50個(gè)，2mL）、乙腈（120 mL）、甲醇（色譜級(jí)，300 mL）、蒸餾水
注：若用自動(dòng)進(jìn)樣器，需要樣品瓶，測(cè)定時(shí)將不少于 1mL 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入樣品瓶中。無(wú)自動(dòng)進(jìn)樣器，需手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，不需要樣品瓶，用進(jìn)樣針將不少于 20ul 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品打入進(jìn)樣閥。
試劑的組成和配制：
試劑一：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 100mL，形成 NAD 和 NADH 提取液（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈），4℃保存 3 個(gè)月；
試劑二：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，粉劑 3×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑1、粉劑 2 和粉劑 3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動(dòng)相緩沖液基質(zhì)（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃保存 3 個(gè)月。
試劑三：NAD 標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的試劑-20℃保存。
試劑四：NADH 標(biāo)準(zhǔn)品5mg×1 支，-20℃保存。加入1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的試劑-20℃保存。
實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：
- 將蒸餾水 1000 mL、流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL、甲醇 300 mL 和乙腈 120 mL 用0.45 μm 的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水和緩沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾，乙腈用有機(jī)系濾膜抽濾）。
- 流動(dòng)相的配制：將抽濾完畢的流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 與乙腈配比為 9：1（v/v），即取 900mL 緩沖液基質(zhì)與 100 mL 乙腈混合。[每個(gè)樣品需要約 12mL 流動(dòng)相，流動(dòng)相用量（mL）=12mL×樣品數(shù)量+跑基線用量（約 50mL），流動(dòng)相的用量請(qǐng)根據(jù)樣品數(shù)量用多少配多少]。
- 將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸餾水各 250 mL。
- 將 2 和 3 中的溶劑超聲 30min，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。
輔酶ⅠNAD(H)的提取：
組織處理：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一，提取 NAD 和 NADH，20000 g，4℃離心 30 min，取上清液用 0.22μm 水系針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)。
細(xì)胞處理：收集于 60 mL 細(xì)胞，離心菌體經(jīng)高壓冷凍干燥 12 h 后，加入 2 mL 試劑一。超聲破壁細(xì)胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s，間隔 2 s)，再經(jīng) 10000 g 4℃離心 40min，上清用 0.22μm 水系微孔濾膜過(guò)濾后直接上柱檢測(cè)。
輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)定操作步驟：
- 開(kāi)啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開(kāi) empower 軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣 量20μL，流速 0.8 mL/min，保留時(shí)間 15min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm,設(shè)置完畢保存方法組。
- 用 100%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min。
- 用流動(dòng)相洗柱子，待基線穩(wěn)定后開(kāi)始加樣。
- 加入標(biāo)準(zhǔn)品 20 μL，在 15min 內(nèi)可分離 NAD 和 NADH， NAD 的保留時(shí)間在 3min左右，NADH 的保留時(shí)間在 7min 左右（柱子不同，保留時(shí)間有差異），計(jì)算不同濃度的 NAD 和 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。
- 加入樣品 20 μL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測(cè) NAD 和 NADH 的峰面積。
輔酶ⅠNAD(H)含量的計(jì)算：
- NAD 含量的計(jì)算
NAD 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
將5mg/ml 的 NAD 標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋成 110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和 20 μg /ml 的 NAD 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為: y = 25069χ- 26754（χ為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積） NAD 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積+26754）÷25069÷蛋白濃度（mg/mL） NAD 含量（μg/g mass）=（樣品峰面積+26754）÷25069÷樣本鮮重（g/mL）
- NADH 含量的計(jì)算
NADH 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
將 5mg/ml 的 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋成 200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml 和50 μg/ml 的 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為: y = 13275χ+35717（χ為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積） NADH 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積 - 35717）÷13275÷蛋白濃度（mg/mL） NADH 含量（μg/g 鮮重）=（樣品峰面積 - 35717）÷13275÷樣本鮮重（g/mL）
注：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 NAD 和 NADH 濃度確定，樣品中 NAD 和 NADH 的峰面積必須落在不同濃度的 NAD 和 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線緊供參考。
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