蛋白質(zhì)含量的測(cè)定→Folin酚法
目的要求
學(xué)習(xí)Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。
實(shí)驗(yàn)原理
Folin-酚試劑法zui早是由Lowry確定的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本方法。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，要嚴(yán)格控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如—CO—NH2，—CH2—NH2，CS—NH2以及Tris緩沖液、蔗糖、硫酸銨、疏基化合物均可干擾Folin-酚反應(yīng)，而且對(duì)后者的影響還要大得多。此外，酚類(lèi)、檸檬酸對(duì)此反應(yīng)也有干擾作用。
Folin-酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色配位化合物。乙試劑是由鱗鉬酸和麟鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中*的酚基還原呈藍(lán)色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測(cè)定*和*的含量。
本法可測(cè)定范圍是25～250ug蛋白質(zhì)。
試劑和器材
- 試劑
（1）、Folin-酚試劑甲：
A·4%碳酸鈉溶液；
B·0.2mol/L氫氧化鈉溶液；
C·1%硫酸銅溶液；
D·2%酒石酸鉀鈉溶液。
臨用前將a與b等體積配制碳酸鈉-氫氧化鈉溶液。c與d等體積配制成硫酸銅-酒石酸鉀鈉溶液，然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin-酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。
（2）、Folin-酚試劑乙。稱(chēng)鎢酸鈉（Na2WO2·2H2O）100g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g置2000mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開(kāi)口煮沸15min，以出去多余的溴。冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾即成Folin-酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。若此貯存液使用過(guò)久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。
試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。乙之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以*為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時(shí)即為滴定終點(diǎn)。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度應(yīng)用。
2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
（1）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。結(jié)晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成150ug/mL蛋白溶液。
（2）、待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。人血清，使用前稀釋150倍。
3、器材
試管1.5cm×15cm（×6），試管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。
注意事項(xiàng)
(1)、Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而Folin-酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)Folin-酚乙試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)產(chǎn)生在麟鉬酸-麟鎢酸試劑被破壞之前。
（2）、血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，若超過(guò)此范圍則需將血清酌情稀釋。
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