ELISA顯色液TMB的增加適度
ELISA顯色液TMB的增加適度?
自己用用夾心放測(cè)大鼠血清中IgE含量，從包板子到顯色讀數(shù)都是自己做。
大體步驟如下：
用Rat anti-mouse IgE包被ELISA板，每孔100ul，4度12-16小鼠
洗板封閉，封閉液150ul
棄掉封閉液，加入稀釋的待檢血清80ul，4度過(guò)
洗板，加入Biotin- Rat anti-mouse IgE 75ul, 室溫2小時(shí)
洗板，加入avidin-HRP 72ul，室溫40分鐘
洗板，加TMB顯色液60ul，適時(shí)加強(qiáng)酸90ul終止。
自己的問(wèn)題：
zui開始時(shí)，包被液、封閉液、血清、Biotin連的抗體、avidin-HRP及TMB都是加100ul，后來(lái)知道了ELISA的原理了之后，就做了上邊的調(diào)整，自己調(diào)整的原因是封閉液是結(jié)合板子上非特異結(jié)合的位點(diǎn)，所以可以多加一些，后邊越加越少是覺(jué)得有時(shí)排槍加樣不小心會(huì)帶有氣泡，如果都是一樣的體積的話，氣泡有可能影響zui頂層液面和板壁上抗原的結(jié)合（但每回都會(huì)放在搖床上孵育，也觀察過(guò)氣泡基本會(huì)自行消失）。自己每次加TMB顯色，總是觀察到剛加進(jìn)去不一會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色出現(xiàn)的很明顯，過(guò)一會(huì)變化就不太大了，我看各個(gè)孔之間差異還很明顯就加強(qiáng)酸終止了（也就5-6分鐘），讀板發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線還可以，R2可以到0.99；問(wèn)題是TMB顯色液有一定的顯色能力嗎？自己加的少的話是不會(huì)影響zui后的吸光值？（原來(lái)加100ul的時(shí)候，吸光值可以到2.2-2.3，但是吸光值再也不會(huì)高了），現(xiàn)在往往zui大的樣本能到1.6-1.7，看別人都*顯色10-30分鐘，是自己的顯色時(shí)間不夠嗎？
此外，zui后終止時(shí)是否應(yīng)該加入等量的終止液，否則液體被稀釋了就不能反映原始的吸光度值了？
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