ELISA試劑盒操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA試劑盒，標準曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，*較呈直線的部分是的檢測區域。甲胎蛋白質示例見圖4-1。
測定小分子量物質常用競爭法（參見2.2），其標準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA試劑盒測定的標準曲線示例見圖4-2。注意圖中橫坐標為對數關系，這更有利于測定系統的表達。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中一夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
