試驗(yàn)辦法
1.a混合抗原直接測(cè)驗(yàn)
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章敘述的辦法，將1.2ml大鼠原血清參加7.0ml10％丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜，用蒸餾水漂洗后，切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對(duì)照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。ELISA試劑盒在上述裝有NC膜的試管中參加10ml DMSO，充沛搖勻，室溫1h；參加等體積0．1mol／L pH9．0*溶液，充沛混勻。3000r／min離心3～5min，搜集沉積，即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0．01mol／L pH7.4 PBS-T洗刷離心3×5min；用含0.3％的1：50正常羊血清封閉、阻斷37°C30min或4°C冰箱；同上離心后用PBS將微粒體積調(diào)至5ml、用0.5ml離心管分裝，每管參加100μl微粒懸濁液；在各管平分別參加100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗刷離心3次，參加100μl含0.1mol／L檸檬酸、0.2mol／L*、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液，于37°C暗環(huán)境反響120min；每管參加1滴2mol／L硫酸停止反響，同上離心，搜集上清并參加96孔ELISA試劑盒酶聯(lián)板，用酶標(biāo)儀測(cè)驗(yàn)波長(zhǎng)490nm處OD值。重復(fù)測(cè)驗(yàn)3次。
1.b電泳分離抗原測(cè)驗(yàn)
首先免疫轉(zhuǎn)印判定抗原，ELISA試劑盒再依據(jù)免疫轉(zhuǎn)印成果進(jìn)行定位，將特定抗原帶裁下，丈量NC膜面積，同大將NC膜微粒化處理并進(jìn)行定量免疫測(cè)驗(yàn)。
2 試驗(yàn)成果
用混合抗原直接測(cè)驗(yàn)和用電泳分離抗原進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，抗體濃度與OD值間均有較好線性關(guān)系，當(dāng)抗體濃度為0.25～1．0ng／ml時(shí)線性，且陽(yáng)性組和陰性對(duì)照組OD值落在規(guī)模，即陰性對(duì)照組OD值為0.3左右，陽(yáng)性對(duì)照組為1.0左右。3次重復(fù)成果共同。
3 評(píng)論
用ELISA法進(jìn)行測(cè)驗(yàn)時(shí)，包被條件十分要害，對(duì)用于包被的抗原或抗體要求較高，其使用規(guī)模受限制。NC膜具有很強(qiáng)的吸附才能，從而呈現(xiàn)了以該資料為根底的斑駁免疫檢測(cè)法。其對(duì)被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于檢測(cè)，但吸附時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)，被吸附抗原如果含有表面活性劑便不能用于檢測(cè)。為了戰(zhàn)勝上述缺陷，我們?cè)⒘艘环N電泳吸附斑駁免疫法，但該法需要將NC膜逐個(gè)截成小圓片放入酶聯(lián)板中，操作也不便利，定量不行。
NCMPE法將電泳吸附抗原的NC膜變成微顆粒，分裝便利，能保證其均一性，定量，因?yàn)樵陔x心管中操作、洗刷等處理極為便利。免疫轉(zhuǎn)印技能是抗原抗體檢測(cè)方面的重大突破，但使用該辦法難以將抗體定量。NCMPE法將免疫轉(zhuǎn)印辨認(rèn)的特定抗原帶處理成微顆粒，然后用ELISA試劑盒法定量測(cè)驗(yàn)抗體水平，充沛發(fā)揮了免疫轉(zhuǎn)印技能的高分辨率和ELISA定量法的高度性與高度靈敏性，可極為便利而地將某種未知抗體定量。
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