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技巧|ELISA高背景的分析-elisa所遇問題分析
點擊次數：2264 發布時間：2017-10-13
ELISA實驗過程中常常出現讓人難以琢磨的結果。其中陰性對照出現高背景的情況也時有發生，這樣導致結果不那么可性。出現高背景的原因可能如下。
1
抗體、抗體的濃度不合適
抗體質量不好，特異性不高可能會與封閉液（BSA）產生交叉反應，這點我遇到過，后來用0.8%的明膠代替，本底就很好了。
抗體親和力不好，也會如此，由于加大了抗體的使用量，必然造成了非特異性增加的可能。
2
封閉液成分、封閉液的濃度、封閉時間
封閉液，如BSA可能與抗體發生交叉反應，導致背景偏高。
封閉液的濃度偏低，封閉時間過短，導致封閉不*，抗體與酶標板孔結合，也可能導致背景偏高。
3
孵育時間、孵育溫度
孵育時間過長 、溫度過高，也可能會導致非特異性結合增加，從而造成本底增高。
4
洗板液成分、洗板的時間
一般用PBS洗板就可以了，但有時候可以在洗板液中加入一些表面活性劑，如tween-20.
洗板的時間不足，會導致抗體殘留，引起陰性對照顯色。如果是機洗，可以改為手洗少量嘗試，增加洗板時間。機洗一般沒有手洗去除干凈。
5
顯色時間
由于系統優化不好，導致樣品顯色較弱，而延長了顯色時間，這樣一來導致陰性對照也有部分顯色。此時，應該優化檢測系統，調整包被物、檢測抗體、底物等的濃度，縮短顯色時間，顯色一般不超過15min。
6
樣品
樣品中含有干擾物質。此時可以優化系統，調整其他檢測抗體的比例，而增加樣品的稀釋度、增加洗脫步驟等。
7
ELISA板的選擇
聚苯乙烯制備的ELISA板經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體的一種，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
如下圖，是分別使用兩種不同廠家的ELISA做的同一種實驗，背景*不一樣。
此外，配制時間過久的CB包被液，也會使樣品和陰性對照的OD值稍微偏高，可能是由于放置太久，導致CB液的pH變化所致。