酶結合物可以說是酶免疫測定試劑盒的核心組成部分。通常酶免疫測定試劑盒的有效使用期限即是根據酶結合物的穩定性而定的。因為在酶免疫測定試劑盒中，zui易受外環境影響的組成試劑即是酶結合物。此外，酶結合物的質量亦是影響試劑盒質量的很重要的因素之一，可見酶結合物的制備對于酶免疫測定來說，是非常關鍵的一個環節。

    酶—抗體（或其他大分子蛋白）結合物是酶免疫測定的有機組成部分，也是其測定基礎之所在。通常，酶結合物（酶標抗體或抗原）一般均是通過化學交聯而得到的。一個理想的化學交聯方法應能得到分子組成明確、酶及抗體或抗原不失活、連接鍵穩定且經濟的*耦合的結合物。

    酶—蛋白的耦合方法可分為三大類，即①酶與蛋白的隨機共價交聯方法；如戊二醛方法；②通過特定化學基團進行共價交聯的方法，如過碘酸鈉方法及采用各種均一和非均一雙功能交聯劑的方法；③通過非共價鍵交聯的方法，如酶—抗酶免疫復合物方法。這些方法各有其優缺點，如戊二醛方法，由于交聯的隨機性，所得到的酶結合物大小不一，其中許多分子量很大，超過1 000kD，這樣的酶結合物的酶活性與游離酶相比，將大大降低。此外，大分子的酶結合物在免疫測定還有可能對測定形成空間位阻。使用過碘酸鈉方法制備酶結合物，操作簡單，所得到的酶結合物大小合適，酶的活性可以保留80％以上。酶—抗酶免疫復合物這種非共價鍵交聯方法并非嚴格意義上的酶—蛋白耦聯方法，本處不做介紹。

下面介紹幾個具體的酶與蛋白大分子的交聯方法。

    1、過碘酸鈉方法

    Nakame和Kawaoi于1974年設計了這種可用于糖蛋白且極為有效的化學耦聯方法，以后又有人對這種方法進行了改良，這種改良方法是目前用于HRP標記抗體或抗原的zui常用的方法。與GA方法比較，這種方法的得到的耦聯物的產率至少要高3～4倍。方法的原理如下：過氧化物酶的所有氨基首先用1—氟—2，4—二硝基苯（Sanger試劑）（DNFB）不可逆地封閉，然后用Nal04氧化過氧化物酶的糖鏈（占總重量的21％），產生醛基和羧基，醛基與所加入的蛋白（1gG或SPA）的游離氨基形成Schiff堿（但不與本身已封閉的氨基作用），這種不穩定的氨基—羰基化合物可用硼氫化鈉（NaBH：）還原形成穩定的耦聯產物。這種方法大約會使70％的過氧化物酶和約99％的IgG耦聯。每個IgG分子zui多可耦聯5—6個過氧化物酶分子。如要得到每個IgG分子結合酶分子的一定比，可在理論上計算出應加入到抗體中的活化的過氧化物酶的量。

    2、使用化學交聯試劑耦聯酶與抗體或其他蛋白

    用于酶與抗體或其他蛋白耦聯的所有化學交聯試劑至少要有兩個反應基團，根據其兩個反應基團是否相同分為均一的和非均一的交聯試劑。均一的雙功能交聯劑，其兩個反應基團相同；而在非均一的雙功能交聯劑中，兩個反應基團不同，每個基團可能于不同的條件下反應。理論上，非均一交聯劑的基團的結合反應易于控制。一般來說，均一的雙功能試劑只能用于一步法，即將酶和其他蛋白（例如抗體、抗原、SPA或親合素）與交聯劑一起混合后反應。一步法難于控制結合物的大小和組成。如果第二個基團的活化要求不同的條件或待交聯蛋白之一與該交聯劑反應不強時，某些均一的雙功能交聯劑亦可用于兩步方法。