一、實驗目的

1、了解抗血清制備的基本過程：

2、掌握抗血清的收集和保存方法。

二、實驗原理

    抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動物被人工注射某類抗原后制備的動物血清。價的抗血清用于研究工作以及疾病的診斷和治療。

    一種抗原能否引起抗體生成反應，一方面取決于抗原分子表面有無抗原決定簇（antigenic determinant），另一方面取決于機體的免疫狀態，當具備以上兩個條件后，抗體生成將遵循抗體生成的一般規律——初次反應和再次反應。

    抗原的種類繁多，包括天然的蛋白質抗原和細胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫動物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫動物需加用佐劑，尤其在使用可溶性抗原時，以期得到價的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質需先通過人工的方法與蛋白質載體連接后再與佐劑混合免疫動物，方可獲得理想的免疫效果。使用佐劑后可增加抗原的免疫原性和延長抗原在機體內存留的時間，從而改變了抗原原有的免疫原性。

三、實驗材料：

1、金屬編號牌（對動物作標記錄）或染料；

2、1毫升，5毫升、20毫升注射器；

3、*頭（9#，12#），卡價苗針頭（41/2 # — 51/2 #）；

4、滅菌平皿，疫苗瓶，*瓶，皮塞以及吸管，脫脂棉；

5、卡介苗（75mg/ml）；

6、抗原（小鼠血清）；

7、*溶液，*溶液和5%葡萄糖溶液；

8、液體石臘（醫用），羊毛臘（配制佐劑用）；

9、滅菌生理鹽水，消毒用酒精，2.5%碘酒；

10、1.5%瓊脂，玻板，飯盒（保濕、保濕作用）；

11、實驗動物（家兔）。

四、實驗步驟

1、動物的選擇

    羊、馬、雞、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫動物，在實驗中，選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關系、抗原性質與動物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動物個體等因素。免疫用動物應選適齡、健壯．為雄性。zui常用的實驗動物是家兔，一般選擇選擇年齡在6個月以上當年繁殖的♂性，體重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金屬編號牌固定兔耳，或用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標記。

2、抗原制備

    1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml，于免疫前一天加入*溶液，使每毫升抗原溶液含*1000 UI，*1000 UI，放4℃隔夜（一般可不加青、*）次日取出，與佐劑混合制成乳劑后用于動物免疫。

    免疫原的注射劑量應考慮其抗原性的強弱、分子量大小、動物的個體狀態和免疫時間。對于純的可溶性抗原的免疫劑量，通常小鼠抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次，兔為100μg ～1 mg/次，合成免疫原為2 mg(半抗原約為20～200μg)，一般需要與等量的福氏*佐劑混合。加強免疫的劑量為計量的1/2，通常用不*福氏佐劑或不用佐劑。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法；反之，欲獲得價的抗血清，宜采用大劑量抗原長程免疫法。

    2）佐劑和抗原乳劑的配制

    1、佐劑的配制：福氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant），各實驗室的配方不盡相同，我室采用的配方如下：

    醫用液體石臘 20毫升

    羊毛脂 12克

    水浴溶化、混勻，分裝于*小瓶，用紗布、線繩扎緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌，4℃保存備用。于免疫前準備抗原乳劑制備時，以活卡介苗（有時亦用死卡介苗）代替死結核菌，每毫升試劑中加入10mg活卡，即為福氏*佐劑。

    2、抗原乳劑的制備：其方法一般有兩種，其一，將等量的*佐劑（注意佐劑必須預先加熱融化，但不超過50℃）和抗原溶液分別吸入兩個5ml注射器內，在兩個注射器的12# 針頭間套上一根長約8～12cm的醫用無毒塑料管，將兩個注射器連接在一起（塑料管必須先經酒精浸泡消毒，使用時取出，用滅菌生理鹽水沖洗后，與注射器針頭相連接，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松，稍緊些為宜），針頭插進塑料管約1～2cm然后由兩人相對而坐后緩緩推動針蕊，使管內溶液進入塑料管道至對側注射器內，每次推動針蕊時必須把管內容物全部推出，另一側也同樣操作，使管內液體往返混合，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止。

    其二是，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內，經過反復碾磨，也可形成油包水乳劑，該法主要優點是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附過多，浪費佐劑及抗原。

    制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此，必須進行質量檢查，檢查的方法是將制成的乳劑滴一滴在涼水（自來水）表面，質量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者進入水面后立即擴散，水面油亦逐漸擴大，這就必須要繼續操作至質量合格為止。但有時，由于佐劑的配制質量原因，很難乳化至合格，遇有這種情況，須考慮重新配制佐劑。

    3、免疫途徑，劑量和免疫周期

    抗原注射途徑可根據不同抗原及試驗要求，選用皮內、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結內等不同途徑注入抗原進行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴結周圍、耳后等處皮內或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周。常規免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加強免疫，每次間隔2～3周，皮下或腹腔注射加強免疫。

    1）常規（皮內多點注射）免疫：

    1*次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內各注射0.2 ml，其余0.6 ml分多點注入脊柱二側，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結附近部位皮內，每點可注入0.05ml，分12點注入。

    2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不*佐劑。注射部位在腹部皮下多點注射，每點注入0.1 ml。

    3第三次免疫：再次免疫后兩周內進行，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清，試血測定效價。

    2）淋巴結免疫：主要優點是可減少抗原用量。過程如下：

    1卡價苗致敏：免疫前足掌皮下每側各注入活卡價苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右觀察兩側腘窩淋巴結，一般可腫脹如蠶豆大小，此時即可進行淋巴結內免疫注射。

    2*次免疫：用手淋巴結后在兩側腘窩淋巴結內各注入抗原乳劑0.25ml，每只兔總量0.5 ml；為加強免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。

    3二周后可如同*次免疫的劑量和途徑再注射一次，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價，效價如已達到要求可不必進行第三次免疫。有條件的情況下，免疫后要加強動物飼料管理，如給熟黃豆飼養等。

    3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細胞性或顆粒性抗原，而且抗原性較強者，例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。