細菌、放線菌的生長繁殖對pH一般要求偏堿，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此，分離培養基的pH應該調節到被分離微生物要求范圍。這不僅有利于自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。

    分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產生菌時，可以把培養基調到pH9～11，在此范圍內不宜生長的微生物被抑制，這對分離培養基本身起到濃縮作用。大多數水解酶的生長zui適pH基本相近，而酶的作用pH未必與產酶pH相同。

    培養基的pH要結合營養成分和培養條件來考慮。因為微生物在生長繁殖過程中，由于代謝作用會產生酸性或堿性產物，pH發生變化，微生物生長受到抑制。一般培養基中碳氮比高者，培養后傾向于酸性，反之則傾向于堿性。無機鹽的性質也會影響pH變化， 2SO4是生理酸性無機氮源，其中NH4+被菌體利用，留下SO42—，培養液變成酸性。而NaNO3是生理堿性氮源，其中NO3—被菌體分解利用后，剩余Na+，使培養液變成堿性。如發酵過程缺氧，則代謝向有機酸合成方向進行，pH下降。為了維持培養基的ph，一般要加磷酸鹽，如K2HPO4、KH2PO4，使培養基具有一定的緩沖能力。如果培養液中的酸堿變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足以調節pH變化，則可適當加入碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過程中產生的酸類，使培養基的pH能保持在恒定的范圍內。此外，在分離霉菌時，加幾滴乳酸不僅可以維持一定酸堿度，而且可以抑制細菌的生長。