Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡試劑盒說明書
一、測定意義：
Annexin 是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷酯結合蛋白，參與細胞內的信
號轉導。Annexin V 選擇性結合磷酯酰*(phosphatidylserine，簡稱 PS)。磷酯酰*主
要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把
磷酯酰*外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯酰*暴露到細胞表面后會促進凝血和炎
癥反應。而 Annexin V 和外翻到細胞表面的磷酯酰*結合后可以阻斷磷酯酰*的促凝血
和促炎癥反應活性。因此 Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用帶有綠色熒光
的熒光探針 FITC 標記的 Annexin V，即 Annexin V-FITC，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常
簡單而直接地檢測到磷酯酰*的外翻這一細胞凋亡的重要特征。
Annexin V-FITC 細胞凋亡測劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用 FITC 標
記的重組人 Annexin V 來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰*的一種細胞凋亡檢測
試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。
本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整
性的細胞，呈現紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-FITC 可以
進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷酯酰*結合，從而也使壞死細胞呈現綠色熒光。因
此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
二、試劑盒組成：
試劑 試用裝 5T 20T 50T 儲存條件
Annexin V-FITC 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
結合液 2.5 ml 10 ml 25 ml 4℃保存
碘化丙啶 （PI） 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、移液器、1.5ml 離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不
含 EDTA 的*消化液
四、保存條件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長期保存，可以把
Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液適當分裝后-20℃保存，Annexin V-FITC結合液可以直接-20℃

五、注意事項：
1、如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
2、染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
3、熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也
盡量注意避光保存。
4、需自備PBS。
5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
6、本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低于1×105，，不適用于檢測
組織樣本。
7、因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，
因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。
8、用流式細胞儀檢測，激發波長 Ex=488 nm; 發射波長 Em=530 nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光
通過 FITC 通道（FL1）檢測；PI 紅色熒光通過 PI 通道（FL2 或 FL3）檢測，建議使用 FL3。熒
光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和
設定十字門的位置。

六、操作規程
1、對于懸浮細胞：
A、在進行完細胞凋亡刺激后，1000g (約1000～2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用
PBS輕輕重懸細胞并計數。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細
胞的作用，可以保證后續Annexin V-FITC的結合。）
B、取1～5×105
重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500μl 結合液輕輕重懸細胞。
C、加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
D、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
E、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯
微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。

2、對于貼壁細胞：
A、把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，用*細胞消化液(不
用含有EDTA)消化細胞。（注：*消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）
B、細胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000g離心
5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。。
C、取1～5×105
重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500μl結合液輕輕重懸細胞D、加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
E、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
F、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯
微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。
3、對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
[注]：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A、(選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內；或將細胞于蓋玻片上生
長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組。
B、吸除細胞培養液，加入PBS洗滌兩次；或將蓋玻片用PBS洗滌兩次。
C、在500μl的結合液中加入5μl Annexin V-FITC， 5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
D、將上述溶液滴加于培養板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。
E、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘
F、隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。