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高壓滅菌條件及驗證的基本要求
點擊次數：4289 發布時間：2015-3-13
滅菌條件及驗證的基本要求
高壓蒸汽濕熱滅菌條件一般通常采用121℃×20min或116℃×40min的程序，也可采用其它溫度和時間參數。總之，必須保證物品滅菌后的SAL≤10-6。總之，必須驗證所采用的滅菌條件能達到無菌保證要求。在實際應用中，對熱穩定的產品或物品，可采用過度殺滅法菌，其SAL應≤10-1212。對熱極為敏感的產品，可的允許標準滅菌時間F0可低于8min。，但對F0低于8的滅菌程序要求應在生產全過程中，對產品中污染的微生物嚴加監控，并采取各種措施防止耐熱菌污染及降低微生物污染水平，以確保被滅菌滅菌產品達到無菌保證要求。滅菌物品的表面必須潔凈，不得污染有機物質。必要時，外表應用適宜的包皮寬松的包裹，特別是燒瓶、試管等容器的塞子要防止脫落。滅菌柜內的物品裝載方式應保證滅菌蒸汽*穿透物品，且不影響蒸汽穿透速度和滅菌后的干燥程度。滅菌柜中的空氣應排空并被飽和蒸汽*替代,以保證表壓與滅菌柜內壓力的一致。
一、采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應有適當的包裝和裝載方式，保證滅菌的有效性和均一性。
蒸汽滅菌法濕熱滅菌工藝驗證時，應進行熱分布試驗、熱穿透試驗和生物指示劑驗證試驗。以確定滅菌柜空載及不同裝載時腔室里中的熱分布狀況及可能存在的冷點；在空載條件下，確認121℃時腔室的各點的溫度差值應≤±1℃、；使用插入實際物品或模擬物品內的溫度探頭，確認滅菌柜在不同裝載時，zui冷點物品的標準滅菌時間（F0）達到設定的標準；用生物指示劑進一步確認在不同裝載時冷點處的滅菌物品達到無菌保證水平。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子。
二、干熱滅菌法
指物品于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設備中、利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質的方法，在干熱滅菌柜、連續性干熱滅菌系統或烘箱等設備中進行滅菌。可用適用于耐高溫但不宜用蒸汽濕熱滅菌法滅菌的物品的滅菌，也是zui為有效的除熱原方法之一，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。
干熱滅菌條件一般為160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它溫度和時間參數。總之，應保證滅菌后的產品其SAL≤10-6。干熱過度殺菌殺滅后產品的SAL應≤10-12，此時物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。干熱滅菌250℃45min的干熱滅菌也可除去無菌產品包裝容器及有關生產灌裝用具中的熱原物質
采用干熱滅菌時，被滅菌物品應有適當的包裝和裝載方式，保證滅菌的有效性和均一性。用本法滅菌的物品表面必須潔凈，不得污染有機物質，必要時外面應用適宜的包皮寬松包裹。配有塞子的燒瓶、試管等容器口應有金屬箔或紗布等包皮包裹，并用適宜的方式捆扎，防止脫落。干熱滅菌箱內物品排列不可過密，保證熱能均勻穿透全部物品。 干熱滅菌法驗證與蒸汽濕熱滅菌法相同，應進行熱分布試驗、熱穿透試驗、生物指示劑驗證試驗或細菌內毒素滅活驗證試驗。以確認滅菌柜中的溫度分布應符合設定的標準、確定zui冷點位置、確認zui冷點標準滅菌時間（FH）能保證達到設定標準并達到SAL要求。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis)。細菌內毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000單位的細菌內毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內毒素至少下降3個對數單位。細菌內毒素滅活驗證試驗所用的細菌內毒素一般為大腸桿菌內毒素。驗證時，一般采用zui大裝載方式。
三、輻射滅菌法
本法系指將滅菌產品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法zui常用的為60Co-γ射線輻射滅菌。醫療器械、容器、生產輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。
采用輻射滅菌法滅菌的無菌產品其SAL應≤10-6。γ射線輻射滅菌所控的參數主要是輻射劑量（指滅菌物品的吸收劑量）。該劑量的制定應根據考慮產品滅菌物品的適應性和及產品可能污染的微生物zui大數量及zui強抗輻射力，所使用的劑量事先應驗證其有效性及安全性。常用的輻射滅菌吸收劑量為25kGy。對zui終產品、原料藥、某些醫療器材應盡可能采用低輻射劑量滅菌。滅菌前，應對待被滅菌物品微生物污染的數量和抗輻射強度進行測定，以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。
滅菌時，應采用適當的化學或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進行監控，以充分證實滅菌物品吸收的劑量是在規定的限度內。如采用與滅菌物品一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置于規定的部位。在初安裝時計量劑量計應用標準源進行校正，并定期進行再校正。
當60Co-γ輻射用于中藥非滅菌制劑滅菌以控制其微生物污染水平時，一般zui高輻射吸收劑量為：散劑及含原粉膠囊劑3kGy、丸劑5kGy、半成品粉末6kGy。輻射滅菌后的物品，應進行微生物檢測，同時應測定中藥滅菌輻射前后的主要藥效成分是否變化，以確定該方法的安全性和有效性。60Co-γ射線輻射滅菌法驗證時，除進行生物指示劑驗證試驗外，還應確認空載和裝載時滅菌腔內的輻射劑量的分布圖、滅菌物品的吸收劑量及zui大和zui小吸收劑量的分布、滅菌物品的均一性、滅菌腔內物品的裝載方式等。常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子。
四、氣體滅菌法
本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。在充有滅菌氣體的高壓腔室內進行。常用的化學消毒劑有環氧乙烷、氣態過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用于在氣體中穩定的物品滅菌。采用氣體滅菌法時，應注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。
本法中zui常用的氣體是環氧乙烷，一般與80％～90％的惰性氣體混合使用。該法可用于醫療器械，塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環氧乙烷的物品則不宜使用。另外，使用氣態過氧化氫和臭氧（O3）滅菌，因其無危害性殘留物，不會對操作人員和環境造成危害，適合于空間和物品表面的滅菌。
采用環氧乙烷滅菌時，滅菌柜內的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因數。可采用下列滅菌條件：溫度（54±10）℃；相對濕度（60±10）%；滅菌壓力8×105Pa；滅菌時間90min；滅菌條件應予驗證。滅菌時，先將滅菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內達到設定的溫濕度平衡的額定值，再通入經過濾和預熱的環氧乙烷氣體。滅菌過程中，應嚴密監控腔室的溫度、濕度、壓力、環氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應在技術熟練人員的監督下進行。滅菌后，應采取新鮮空氣置換，使殘留環氧乙烷和其他易揮發性殘渣消散。并對后通入環氧乙烷殘留物和反應產物進行監控，以證明其不超過規定濃度，避免產生毒性。 環氧乙烷滅菌法驗證時，應進行如下試驗：泄露泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性；生物指示劑的驗證試驗，指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis)；滅菌后換氣次數的驗證試驗，確認環氧乙烷及相應的反應產物含量在限定的范圍內。驗證設計時，還應考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。
五、過濾除菌法
利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去空氣氣體或液體中的微生物的方法。在開放式或封閉式過濾系統中進行。本法廣泛用于制藥行業，特別是常用于對熱不穩定的藥品溶液或原料的除菌。
除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質依過濾物品的性質及過濾目的而定。藥品生產中采用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22μm。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用，也不能釋放物質，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。濾器和濾膜在使用前應進行潔凈處理，并用高壓蒸汽進行滅菌或作在線滅菌。更換品種和批次應先清洗濾器，再更換濾膜。
過濾過程中無菌保證與過濾液體液體的初始生物負載負荷及過濾器的對數下降值LRV(LogReductionValue)有關。LRV是表示系指在規定條件下，待被過濾液體過濾前的微生物數量與過濾后的微生物數量比的常用對數值。 即：LRV=lgN0-LgN 式中N0為產品除菌前的微生物數量。 N為產品除菌后的微生物數量。 LRV用于表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑為0.22μm的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾面積的LRV應不小于7。因此過濾除菌時，應將待被過濾產品總的污染量應控制在規定的范圍限度內。為保證過濾除菌效果，可使用兩個過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。 在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關鍵參數（濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV）進行監控。因此，在每一次過濾除菌前后均應作濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或氣體擴散流量試驗。測定濾器是否符合已驗證過的完整性控制標準，確認濾膜在除菌過濾過程中的有效性和完整性。完整性試驗可使用完整性試驗儀測定。除菌過濾器的使用時間不應超過一個工作日，否則應進行驗證。 過濾系統的驗證包括過濾系統對過濾液體的適應性、過濾材料對溶液的污染程度、過濾器的規格、過濾器的滅菌方法、過濾系統的完整性試驗、生物指示劑試驗、過濾液體的微生物含量控制及過濾時間、過濾器的使用壽命等。上述試驗大部分可由濾器的生產廠商來進行。微生物挑戰性試驗常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌。
通過過濾除菌法達到無菌的產品應嚴密監控其生產環境的潔凈度，建議在無菌環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其它物品應采用適當的方法進行滅菌，并防止再污染。
六、無菌生產工藝
無菌生產工藝系指必須在無菌控制條件下生產無菌制劑（如粉針劑）的方法，無菌分裝及無菌凍干是zui常見的無菌生產工藝。后者在工藝過程中須采用過濾除菌法。無菌生產工藝應嚴密監控其生產環境的潔凈度，并應在無菌控制的環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其它物品應采用適當的方法進行滅菌，并防止被再次污染。
無菌生產工藝過程的無菌保證應通過培養基無菌灌裝摸擬試驗驗證，試驗結果的陽性率不得超過0.1%(置信度取95%)。值不得低于3。因此在生產過程中，應嚴密監控生產環境的無菌空氣質量、操作人員的素質、各物品的無菌性。無菌生產工藝應定期進行驗證，包括對環境空氣過濾系統有效性驗證及培養基模擬分灌裝試驗。
生物指示劑：生物指示劑系一類特殊的活微生物制成的特殊制劑品。可用于確定確認滅菌設備的性能、滅菌物品的滅菌程序的建立和有效性的驗證、滅菌程序的再驗證、供評估產品滅菌是否達到無菌保證要求的依據、無菌空氣過濾系統的評估生產過程滅菌效果的監控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。選擇制備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
(1)菌種的耐受性應大于需滅菌產品中所有可能被污染微生物的耐受性。
(2)菌種應無致病性。
(3)菌株應穩定。存活期長，易于保存。
(4)易于培養。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
1.生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應按一定的程序進行，制備前，應需先確定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐熱參數，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分表示）值等。菌株應用適宜的培養基（如產孢子的培養基）進行培養。培養物應制成懸浮液，其中孢子的數量應占優勢，孢子應懸浮于無營養的液體中保存。生物指示劑中包含一定數量的一種或多種孢子，可制成多種形式，通常是將一定數量的孢子附著在無生命的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示劑還配有培養基系統。生物指示劑應選用合適的材料包裝進行包裝以防止微生物的污染和孢子損耗，，并確定設定有效期。載體和內層包裝材料在保護生物指示劑不被污染和損耗的同時，還應保證滅菌劑穿透必須保證滅菌因子易穿透包裝內的微生物部位并能與生物指示劑充分接觸、不得有任何污染物、在滅菌過程中不被破壞，否則將影響生物指示劑有效性、穩定性及使用。同時載體和包裝應設計應原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種，并能避免這些過程微生物的污染和孢子的損耗。有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。此時必須論證替代品對孢子的生長繁殖沒有影響及孢子的耐受力沒有降低。使用替代品時，應用數據證明二者的等效性。
2.生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數的監控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性更好的zui直觀的指標。滅菌用的生物指示劑可來源于使用商品化市售的標準生物指示劑，或是也可使用由日常生產污染菌監控中分離的zui耐受微生物制備的孢子并經實驗室制備而得。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的耐受性，并測定孢子的純度和數量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在終端zui終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌柜中滅菌因子zui不易到達的部位（zui冷點）的不同部位。若正常生產中需要用生物指示劑進行滅菌效果監測時，應注意放置方式并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養基中培養，確定生物指示劑中的孢子是否被*殺滅。
過度殺菌殺滅產品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用商品化市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產品，設計滅菌程序時，根據經驗預計在該生產工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數量。這類產品的無菌保證應通過監控每批滅菌前的微生物污染的數量和、耐受力性、和滅菌程序驗證所用的生物指示劑數量和耐受力及其他相關的參數獲得的數據進行評估。
3.常用生物指示劑
(1)蒸汽濕熱滅菌法：蒸汽濕熱滅菌法zui常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。D值為1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子數5×105～5×106個，在121℃、19min下應被*殺滅。另外此外，還可使用生孢梭菌孢子(SporesofClostridiumsporogenes如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955)，D值為0.4～0.8min。
(2)干熱滅菌法：干熱滅菌法zui常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，如NCIMB8058、ATCC9372)。D值大于1.5min，每片活孢子數5×105～5×106個。去熱原驗證時使用大腸桿菌內毒素（Escherichiacoliendoxin），加量不小于1000細菌內毒素單位。
(3)輻射滅菌法：輻射滅菌法zui常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(SporesofBacilluspumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142)。每片活孢子數107～108，置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應注意滅菌產品中所負載的微生物可能比短小芽孢桿菌孢子顯示更大強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量的建立。
(4)氣體滅菌法：環氧乙烷滅菌zui常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，如NCTC10073、ATCC9372)。氣態過氧化氫滅菌zui常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。每片活孢子數1×106～5×106個。環氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環氧乙烷濃度為600mg/L，相對濕度為60%，溫度為54℃下滅菌，60min應被殺滅。
⑸過濾除菌法：過濾除菌法zui常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonasdiminuta,如ATCC19146)，用于濾膜孔徑為0.22μm的濾器；黏質沙雷菌(Serratinmarcescens)(ATCC14756)，用于濾膜孔徑為0.45μm的濾器。
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