摘要：

CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學(xué)領(lǐng)域近十年zui熱門(mén)的兩大技術(shù)。現(xiàn)在，科學(xué)家們正在撮合它們聯(lián)姻。雖然CRISPR-Cas9和人類(lèi)iPSC在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)相當(dāng)普及了，但二者相結(jié)合并沒(méi)有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個(gè)工具的專(zhuān)家，推出了在人類(lèi)干細(xì)胞中使用CRISPR的基礎(chǔ)指南。這份指南對(duì)人iPSC和人胚胎干細(xì)胞同樣適用。

CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學(xué)領(lǐng)域近十年zui熱門(mén)的兩大技術(shù)?，F(xiàn)在，科學(xué)家們正在撮合它們聯(lián)姻。

干細(xì)胞能夠分化成為機(jī)體內(nèi)任何類(lèi)型的細(xì)胞，既是研究人體早期發(fā)育的理想工具，也是細(xì)胞治療的寶貴資源。胚胎干細(xì)胞很適合臨床使用，但獲得這些細(xì)胞會(huì)破壞胚胎，有很大的倫理爭(zhēng)議。2006年日本科學(xué)家山中伸彌開(kāi)發(fā)了一個(gè)變通方案，用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（OSKM）引入特化的成體細(xì)胞，再將其重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。這些細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中表現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)哪芰?，又避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞的倫理問(wèn)題，在疾病模擬、藥物篩選和細(xì)胞治療中有著巨大的應(yīng)用前景，被人們視為細(xì)胞療法的新希望。山中伸彌也因?yàn)閕PS技術(shù)贏得了2012年的諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

CRISPR是指規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)，細(xì)菌通過(guò)CRISPR與內(nèi)切酶Cas組成的防御系統(tǒng)對(duì)抗外來(lái)侵略者。CRISPR-Cas能根據(jù)向?qū)NA的指引切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點(diǎn)，將CRISPR系統(tǒng)發(fā)展成了強(qiáng)大的基因組編輯工具。該系統(tǒng)可以簡(jiǎn)單地編輯任何基因組區(qū)域，據(jù)說(shuō)新手可在一周內(nèi)學(xué)會(huì)用CRISPR編輯傳統(tǒng)的永生細(xì)胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者們還在CRISPR的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了調(diào)控基因表達(dá)的新工具。

人們普遍認(rèn)為，iPS與CRISPR的結(jié)合會(huì)起到一加一大于二的效果。舉例來(lái)說(shuō)，CRISPR用于人類(lèi)iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者細(xì)胞的基因缺陷。雖然CRISPR-Cas9和人類(lèi)iPSC在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)相當(dāng)普及了，但二者相結(jié)合并沒(méi)有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個(gè)工具的專(zhuān)家，推出了在人類(lèi)干細(xì)胞中使用CRISPR的基礎(chǔ)指南。這份指南對(duì)人iPSC和人胚胎干細(xì)胞同樣適用。

基本工作流程

在人iPSC中用CRISPR編輯基因或者控制基因表達(dá)，你需要開(kāi)啟兩條平行的任務(wù)線：1）培養(yǎng)充足且可靠的多能干細(xì)胞；2）針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)20nt的向?qū)NA。

研究者們目前主要通過(guò)電穿孔遞送向?qū)NA和Cas9核酸酶，因?yàn)檫@種方法能在保證細(xì)胞存活的同時(shí)送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自動(dòng)化的臺(tái)式系統(tǒng)，比如Lonza的Nucleofector系統(tǒng)和ThermoFisher的Neon系統(tǒng)。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉勸大家，如果不是高通量細(xì)胞篩選，請(qǐng)不惜一切代價(jià)避免慢病毒遞送，因?yàn)槿硕嗄芨杉?xì)胞似乎會(huì)天然沉默慢病毒送入的基因。

抗生素抗性可以幫助我們挑選經(jīng)過(guò)編輯的克隆。研究者們一般將抗生素抗性、熒光報(bào)告基因和流式細(xì)胞儀結(jié)合起來(lái)，富集那些轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，把它們鋪在單孔或多孔板上。通過(guò)追蹤細(xì)胞形態(tài)、多能性標(biāo)志物和細(xì)胞分化能力可以評(píng)估細(xì)胞的多能性。專(zhuān)家建議每10-20代或者每次細(xì)胞操作之后進(jìn)行核型分析，確保細(xì)胞的染色體數(shù)量正常。

iPS細(xì)胞系如今有許多購(gòu)買(mǎi)渠道，各大實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和公司都提供有相應(yīng)的服務(wù)。此外，iPS重編程方案也非常多。加州大學(xué)伯克利分校的細(xì)胞生物學(xué)家Dirk Hockemeyer表示，我們應(yīng)當(dāng)找到自己的方案，在開(kāi)始CRISPR編輯之前一定要很好地掌握這些細(xì)胞。

人多能干細(xì)胞VS人腫瘤細(xì)胞系

專(zhuān)家們還建議，在著手iPSC之前先用人類(lèi)癌細(xì)胞系試一試CRISPR-Cas9工具。在對(duì)iPSC動(dòng)手的時(shí)候牢記一點(diǎn)：操作人iPSC更繁瑣、更講究也更加昂貴。

據(jù)介紹，有經(jīng)驗(yàn)的研究者用大約一個(gè)月的時(shí)間能學(xué)會(huì)基礎(chǔ)的人iPSC培養(yǎng)。由于新方案和試劑經(jīng)常出現(xiàn)，操作這些細(xì)胞是一個(gè)不斷學(xué)習(xí)的過(guò)程，哈佛醫(yī)學(xué)院George Church實(shí)驗(yàn)室的博士后Susan Byrne說(shuō)。“我告訴本科生，如果在正確的指導(dǎo)下操作這些細(xì)胞，你們將在六個(gè)月內(nèi)成為專(zhuān)家。但人們一開(kāi)始總是低估了這種技術(shù)，”哈佛干細(xì)胞研究所的Chad Cowan補(bǔ)充道。

請(qǐng)記住，每一個(gè)干細(xì)胞系都是*的。這會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)和向?qū)NA的效果 。“供體和重編程方法都會(huì)帶來(lái)變異，”Byrne說(shuō)。“有時(shí)我們需要對(duì)特定干細(xì)胞系進(jìn)行方案優(yōu)化。”一般來(lái)說(shuō)，就算細(xì)胞系很健康、實(shí)驗(yàn)方案很，人iPSC和ESC的編輯效率也會(huì)比癌細(xì)胞系低十倍，Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Linzhao Cheng指出。

深入了解你的基因

知己知彼，百戰(zhàn)不殆。了解你想要編輯的基因座，認(rèn)識(shí)那些可能轉(zhuǎn)錄的序列，可以幫助你設(shè)計(jì)出編輯方案。舉例來(lái)說(shuō)，有些基因在編輯之后仍能表現(xiàn)出一定的生物學(xué)活性。在這種情況下，你可能需要切割更大的區(qū)域，Byrne說(shuō)。

選擇多個(gè)向?qū)NA并對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多軟件可以篩選向?qū)NA。不過(guò)，就算是特異性非常好的向?qū)NA也有可能效果不佳，甚至根本不起作用。造成這種情況的原因很多，比如你可能沒(méi)有足夠好的參考基因組。此外，你可能需要優(yōu)化向?qū)NA的活性，加州大學(xué)圣地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說(shuō)。他和George Church領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)在Nature Methods雜志上發(fā)表文章，向人們展示了獲得活躍向?qū)NA的通用設(shè)計(jì)規(guī)則。（更多詳細(xì)信息參見(jiàn)：遺傳學(xué)界大牛Nature子刊發(fā)布CRISPR-Cas9新工具）

將CRISPR應(yīng)用到iPS細(xì)胞中去，可以實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的干細(xì)胞治療，造福多種遺傳學(xué)疾病的患者。James Thomson與Murdoch兒童研究所（MCRI）合作，將重編程與CRISPR基因組編輯結(jié)合到一個(gè)步驟中，顯著縮短了生成基因校正干細(xì)胞的時(shí)間，是實(shí)現(xiàn)個(gè)性化細(xì)胞療法的重要一步。（更多詳細(xì)信息參見(jiàn)：干細(xì)胞成果：CRISPR與重編程的結(jié)合）

2014年11月，遺傳學(xué)大牛George M. Church領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志上展示了CRISPR編輯iPS細(xì)胞的脫靶情況。他們對(duì)人iPS細(xì)胞進(jìn)行CRISPR基因編輯，然后將全基因組測(cè)序和靶向深度測(cè)序結(jié)合起來(lái)，鑒定了Cas9編輯iPS細(xì)胞時(shí)的脫靶效應(yīng)。研究指出，CRISPR編輯人類(lèi)iPSC并沒(méi)有導(dǎo)致顯著的基因組改變或突變率提高，不過(guò)有一種單核苷酸變異（SNV）會(huì)影響Cas9的特異性。（更多詳細(xì)信息參見(jiàn)：遺傳學(xué)大牛文章：CRISPR編輯iPS細(xì)胞的脫靶情況）