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核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明書下載

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核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 
 
描述:本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養細胞中提取核蛋白和/或胞質蛋白,提取制備過程簡便。制備的
核蛋白和胞漿蛋白能保持天然活性,并且純度較高。提取的蛋白特別適于轉錄因子活性分析、凝膠阻滯實
驗(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性測定,也適于 Western Blot 實驗。  
 
核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 組份 
Kit compositions  50 extractions  100 extractions  Storage 
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A)  25 ml    50 ml  4 
o
C, 1 year 
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B)  1.5 ml  2×1.5 ml  4 
o
C, 1 year 
Nuclear Extraction Buffer (NEB)  5 ml  10 ml  4 
o
C, 1 year 
注意:不含蛋白酶抑制劑成分 
 
實驗的一般考慮 
1.  所有的操作都應在冰浴中進行,  所有的試劑在實驗前都要預冷。 
2.  根據大致的細胞數,或者根據離心后的細胞體積(Packed cell volume, PCV),估計試劑加入的量。PCV
因細胞類型不同而有所差異。細胞數、PCV和加入試劑的關系參見下表: 
培養皿直徑  35 mm or  或 1 孔六孔板  60 mm  10 cm 
培養皿面積  10 cm2
  30 cm2
  75 cm2
 
估計細胞數量  5 ×105
  1 ×106
  5 ×106
 
估計 PCV(μl)  5  10~20  50~100 
加入 CEB-A (μl)  25  50~100  300~500 
加入 CEB-B (μl)  1.2~1.5  3~6  3~6 
加入 NEB (μl)  5~10  20  100 
 
操作步驟 
1.  裂解:(1)  培養細胞,PBS 洗滌細胞兩次,估計大致的細胞數,或者估計離心后的細胞體積 PCV。每
1 ×106
個細胞加入 50~100μl 的 CEB-A,刮下細胞轉移至預冷的 1.5ml 離心管;或者每體積 PCV細胞
加入 5 倍 PCV 體積的 CEB-A (即 10~20 μl PCV的細胞加 50~100μl 的 CEB-A),劇烈振蕩重懸。(2) 組
織樣本,稱重后剪成小塊,PBS 洗滌兩次。通常每 10 mg 動物組織相當于 1×106
個細胞,需加入
50~100μl CEB-A,可根據組織重量按比例加入。在冰上用玻璃勻漿器或高速粉碎器破碎組織或細胞。
使用玻璃勻漿器通常需要 20~40 次上下抽動勻漿。 
2.  裂解產物轉移至預冷的 1.5ml 離心管,劇烈振蕩 30 秒,冰浴10~15min,期間每 5 分鐘振蕩 15 秒。 
3.  根據裂解物體積加入 1/20 體積的 CEB-B,振蕩 10 秒,冰浴1min (加入 CEB-B 可去除核膜,適于制備
高純度的核蛋白,但可使胞漿蛋白出現很少量的膜蛋白污染,欲制備高純胞漿蛋白可省略此步驟)。 
4.  1000g 4 o
C 離心 5 分鐘,沉淀即是核粗提物,上清則是粗制的胞漿蛋白組分。 
5.  胞漿組分制備:將上清轉入另一預冷的離心管,12000g 4 o
C 離心,棄沉淀,取上清即得胞質蛋白組分,
于−20~−70ºC 保存。 
6.  核粗提物處理:取第步驟 4 的核粗提物沉淀,加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 振蕩10 秒洗滌沉淀,
冰浴 1min,1000g 5min 棄上清。再次加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 重復此步驟。 
7.  核蛋白制備:在離心沉淀物(細胞核)中加入 50~100μl 預冷的 NEB (可選:使用前每 ml NEB 加入 1μL 
DTT,5μL PMSF,5μl 蛋白酶抑制劑),劇烈振蕩 15 秒,冰上30min,期間每 10 min 振蕩 15 秒。12000g 
5min,上清液含核蛋白成分,其中含有 25%的甘油;轉入新管−20~−70ºC 保存。 
8.  只需對提取的胞質組分進行蛋白定量(Braford或 BCA法),核蛋白純度高但含量低,無需定量。 
 
核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 說明:按照說明書操作,每 106
個細胞可得到 50-75μg 蛋白。試劑盒在不加入蛋白酶抑制劑時仍然工作良
好,但用戶可自行加入。裂解時間是重要的,過短則細胞裂解不全導致蛋白產率低,裂解時間長則導致胞
漿蛋白有核蛋白污染。上述制備的蛋白樣品與 2x SDS-PAGE 混合即可上樣電泳。 
                                                                  DocRev 1006  Page 1 of 1 

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