REAGEN^™黃曲霉毒素B1酶聯免疫反應試劑盒

1．概述

B1酶聯免疫反應測試盒是用于檢測谷類，飼料，肌肉，牛奶，花生和阿月渾子（開心果）中B1的殘留。該試劑盒特點包括：

• 高回收率（80-105%），快速（10-40分鐘）。
• 高靈敏度（0.05ng/g或ppb）
• 高重現性。
• 快速的ELISA檢測方法（在不考慮樣品數量下只需不到2小時）。

2．試劑盒原理

REAGEN^™B1酶聯免疫反應測試盒基于競爭性酶聯反應原理，抗原已經包被于微孔板上。分析時，樣品同一抗加入孔中，如果樣品中含有毒素，會競爭抗體，因而抑制板上包被的毒素與抗體結合。HRP標記的二抗，與結合在板上一抗相結合后，加入TMB底物，底物的顏色顯色強度與樣品中毒素的含量成反比。

3.試劑盒組成

本試劑盒應當在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果一個月內不使用試劑盒，黃霉

素毒素B1標準品，一抗和1×HRP-二抗應置于-20℃或者冷凍保藏。

4.檢測限

5.交叉反應

6．其他需要而本試劑盒未提的設備或材料

• 酶標儀(450nm)
• 恒溫培養箱
• 勻質器
• 漩渦振蕩器
• 微量加樣器(10、20、100和1000mL各一支)
• 多道槍：50-300mL
• 甲醇

7.注意事項

實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得實驗效果。

• 標準品中含有B1，請小心使用。
• 不要使用過期的試劑盒。
• 不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。確保二抗及二抗稀釋液正確配制。
• 盡量保持室溫20-25℃，避免在通風口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發。同樣的，不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應該鋪墊若干紙巾或者其他物料。
• 水質量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。
• 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。
• 孵育時間的計算越規范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。
• 從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質量的風險。
• 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。

8．樣品的準備

    樣品保存在2-4℃不超過1-2天，如果需要保存較長的時間，應該放置-20℃。樣品使用前應恢復到室溫。

1） 干肉/魚，谷類，飼料，種子

• 研磨并混勻適量的樣品；
• 稱取5g磨碎的樣品，放入適當的容器中；
• 加入25mL70%甲醇，用手或者振蕩器劇烈振蕩20分鐘；
• 室溫（22.5±2.5）°C下4000 rpm離心10分鐘；
• 取1mL上清液，加入1mL蒸餾水或者去離子水稀釋；
• 取50μL作檢測。

稀釋倍數：10

備注：如果需要，樣品所取的量可以增加，同時甲醇/水的用量也必須作相應的改變。例如取10g樣品，應該加入50mL70%甲醇。如果樣品中含量很高，那么樣品必須經過稀釋，請用35%甲醇進行稀釋。 

2）肌肉/肝臟/腎臟

• 研磨并混勻適量的樣品；
• 稱取5g磨碎的樣品，放入適當的容器中；
• 加入25mL70%甲醇，用手或者振蕩器劇烈振蕩20分鐘；
• 室溫（22.5±2.5）°C下4000 rpm離心10分鐘；
• 取1mL上清液，加入1mL蒸餾水或者去離子水稀釋；
• 取50μL作檢測。

稀釋倍數：10

備注：如果需要，樣品所取的量可以增加，同時甲醇/水的用量也必須作相應的改變。例如取10g樣品，應該加入50mL70%甲醇。如果樣品中含量很高，那么樣品必須經過稀釋，請用35%甲醇進行稀釋。

3）花生醬

（1）  研磨并混勻適量的樣品

（2）  稱取2g勻質的樣品，放入適當的容器中

（3）  加入4mL35%甲醇，用手或者振蕩器劇烈振蕩20分鐘

（4）  室溫（22.5±2.5）°C下4000 rpm離心10分鐘

（5）  取50μL作檢測

   稀釋倍數：3

4）牛奶

（1）.脫脂牛奶：用35%甲醇按1：9的比例稀釋牛奶樣品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀釋樣品以待檢測

（2）.含脂牛奶：取適量樣品，室溫（22.5±2.5）°C4000g離心5min，棄去上層脂肪層，用35%甲醇按1：9的比例稀釋牛奶樣品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀釋樣品以待檢測

稀釋倍數：10

5）蔬菜/豆類/花生/橄欖油

      （1） 稱取0.5g樣品，加入2.5ml35%的甲醇。

    （2） 渦流10分鐘或高速渦流3分鐘,靜置2分鐘

   （3） 去掉上層脂肪液，取50μL下清液作檢測

    稀釋倍數：5

9．酶聯免疫反應測試步驟

試劑準備

注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍1-2小時，確定在使用前閱讀過注意事項。準備適量的檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的瓶子中，處理試劑時建議用廢棄的瓶子以降低污染的風險。

1x洗液的制備

1體積的20x洗液同19體積的蒸餾水混合

檢測

以下為計算份量的表格，用戶可根據自己的需要來確定需要配置多少試劑。

• 加入50mL的標準液于所設定的孔中；
• 加入50mL的樣品于所設定的孔中
• 在每孔中加入100mL一抗， 輕敲微孔板邊緣混勻60秒；
• 室溫（22.5±2.5）°C避光孵育30分鐘

洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，zui后一次盡量甩干并在吸水紙上吸干；

• 每孔加入150mL 1×二抗工作液，室溫（22.5±2.5）°C避光孵育30分鐘

洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，zui后一次盡量甩干并在吸水紙上吸干；

• 每孔加入100mL的TMB底物，用手敲板邊緣1分鐘混合均勻；
•  室溫（22.5±2.5）°C避光孵育15分鐘， 加入100mL的終止液終止反應。
•  在450nm下讀OD值(讀數前，用無絨布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

10．結果計算

• 分別計算標準、質控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。
• 相對吸光度值 (%) = (標準或樣品吸光度值/零標準吸光度值) ´ 100
• 以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度為橫坐標建立標準曲線。

• 從標準曲線上讀取質控和樣品的濃度值。
• 樣品檢測下限和定量下限計算方法如下：

樣品檢測下限 = (0.05ng/g) ´ (稀釋倍數)

樣品定量下限 = (0.1ng/g) ´ (稀釋倍數)

   備注：如結果呈陽性反應，應該用其他檢驗方法（如色譜/質譜方法等）進行確證。以下曲線圖是B1酶聯免疫反應測試盒的典型標準曲線