細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

主要用途

細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)比色探針對(duì)硝基苯胺標(biāo)記人工合成的乙酰化p53多肽底物，經(jīng)過(guò)SIRT1脫乙酰基后，被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、核蛋白樣品、部分或*純化酶樣品中SIRT1的活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個(gè)蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD+輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴氨酸脫乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙酰基反應(yīng)，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，與酵母Sir2同源性zui高。其功能在于調(diào)節(jié)p53活性和抑制細(xì)胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位點(diǎn)）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用比色染料對(duì)硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來(lái)標(biāo)記乙酰化p53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙酰化，zui后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對(duì)硝基苯胺（波長(zhǎng)405nm），由此來(lái)定量測(cè)定沉默調(diào)節(jié)蛋白1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）  毫升

分離液（Reagent B）  毫升

清理液（Reagent C）  毫升

萃取液（Reagent D）  毫升

緩沖液（Reagent E）      毫升

底物液（Reagent F）      微升

終止液（Reagent G）      微升

酶解液（Reagent H）      微升

補(bǔ)充液（Reagent I）      微升 

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent E）、底物液（Reagent F）、終止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細(xì)胞樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 107細(xì)胞）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 小心加入10毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升裂解液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入xx毫升預(yù)冷的分離液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g 
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent C）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g 
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預(yù)冷的萃取液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為30℃）： 波長(zhǎng)405nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度

三、活性測(cè)定

• 終點(diǎn)法活性測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 分別加入xx微升補(bǔ)充液（Reagent I）或待測(cè)樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升終止液（Reagent G）
• 分別加入xx微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
• 在30℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

• 比色皿檢測(cè)

• 酶動(dòng)法活性測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 分別加入xx微升補(bǔ)充液（Reagent I）或待測(cè)樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育2分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板5秒
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)：間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）――獲得吸光讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

• 比色皿檢測(cè)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 樣品處理時(shí)，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定
• 濾波器可以使用波長(zhǎng)400nm替代405nm
• 測(cè)定值由低到高變化；酶動(dòng)法測(cè)定可以持續(xù)60分鐘
• 測(cè)定值吸光讀數(shù)越高，表明酶活性越高
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 待測(cè)樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1） 
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 沉默調(diào)節(jié)蛋白1單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感