細胞沉默調節蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒

主要用途

細胞沉默調節蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過比色探針對硝基苯胺標記人工合成的乙酰化p53多肽底物，經過SIRT1脫乙酰基后，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對硝基苯胺，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或*純化酶樣品中SIRT1的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細胞核和細胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結構域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD+輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴氨酸脫乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙酰基反應，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基團轉化產生的（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于細胞核內，與酵母Sir2同源性zui高。其功能在于調節p53活性和抑制細胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位點）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用比色染料對硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來標記乙酰化p53多肽底物，其次進行脫乙酰化，zui后底物進一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強烈吸光值的黃色對硝基苯胺（波長405nm），由此來定量測定沉默調節蛋白1的活性。其反應系統為：

產品內容

裂解液（Reagent A）  毫升

分離液（Reagent B）  毫升

清理液（Reagent C）  毫升

萃取液（Reagent D）  毫升

緩沖液（Reagent E）      毫升

底物液（Reagent F）      微升

終止液（Reagent G）      微升

酶解液（Reagent H）      微升

補充液（Reagent I）      微升 

產品說明書     1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent E）、底物液（Reagent F）、終止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細胞樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

培養箱：用于反應物孵育

酶標板或比色皿：用于反應和比色的容器

酶標儀或分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
• 小心抽去培養液
• 小心加入10毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升裂解液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管 
• 強力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入xx毫升預冷的分離液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g 
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent C）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g 
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預冷的萃取液（Reagent D），混勻
• 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好酶標儀或分光光度儀（溫度為30℃）： 波長405nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度

三、活性測定

• 終點法活性測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景空對照和待測樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent E）到相應孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 分別加入xx微升補充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克細胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 放進30℃培養箱里，孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升終止液（Reagent G）
• 分別加入xx微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 在30℃培養箱里，孵育30分鐘
• 即刻放進酶標儀或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數
• 活性計算：

• 酶標儀檢測

• 比色皿檢測

• 酶動法活性測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景空對照和待測樣品

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent E）到相應孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 分別加入xx微升補充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克細胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 放進30℃培養箱里，孵育2分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動96孔酶標板5秒
• 即刻放進酶標儀或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：間隔5分鐘，讀數6次（共30分鐘）――獲得吸光讀數
• 活性計算：

• 酶標儀檢測

• 比色皿檢測

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
• 孵育反應完成后即刻進行比色測定
• 濾波器可以使用波長400nm替代405nm
• 測定值由低到高變化；酶動法測定可以持續60分鐘
• 測定值吸光讀數越高，表明酶活性越高
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1） 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 沉默調節蛋白1單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感