細胞氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑是一種旨在通過捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧化，進而與偶氮染料反應，產生黃色產物，由分光光度儀比色分析未反應棕色成分，來定量檢測細胞內羥自由基活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種細胞（動物、人體等）裂解懸液或培養上清的羥自由基檢測，以及羥自由基激發劑和抗氧化清除劑（scanvenger）等的檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應性和毒性，同時半衰期短（10－9至10－10秒）。其產生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過氧化物和次氯酸反應、過氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產生黃色產物偶氮亞砜（diazosulfone），通過分光光度儀（325nm波長），檢測未反應棕色成分，以測定羥自由基的含量。據此證明細胞內活性氧族的存在。其反應系統為：

產品內容

清理液（Reagent A）    毫升

標記液（Reagent B）    微升

酸性液（Reagent C）    微升

染色液（Reagent D）    瓶

終止液（Reagent E）    毫升

萃取液（Reagent F）    毫升

標準液（Reagent G）    毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）和標準液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發，注意密閉；染色液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準液配制的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于細胞裂解

臺式離心機：用于樣品制備和反應處理

石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備 

選擇一：培養細胞

• 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 106細胞）
• 小心抽去培養液
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g
• 小心移取3毫升上清液到新的預冷的15毫升錐形離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

選擇二：細胞培養液

• 移取3毫升細胞培養液到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g 
• 小心移取3毫升上清液到新的預冷的15毫升錐形離心管
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升清理液（Reagent A）到2至5號管
• 移取xx微升標準液（Reagent G）到1號管
• 小心移取xx微升1號管的標準液（Reagent G）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的標準液（Reagent G）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的標準液（Reagent G）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出xx毫升清理液（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，標記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用12次）。 放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 移取xx微升上述配制的標準液（Reagent G）到2毫升離心管
• 加入xx微升酸性液（Reagent C）
• 加入xx微升染色工作液，手動混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入xx微升終止液（Reagent E），手動混勻
• 加入xx毫升萃取液（Reagent F），手動混勻
• 小心移取1毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
• 即刻（3分鐘內）放進分光光度儀（325nm波長）檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至8四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準MSA濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取200微升待測樣品到2毫升離心管
• 加入xx微升標記液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒
• 室溫下孵育30分鐘
• 加入xx微升酸性液（Reagent C）
• 加入xx微升染色工作液，手動混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入xx微升終止液（Reagent E），手動混勻
• 加入xx毫升萃取液（Reagent F），手動混勻
• 小心移取1毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
• 即刻（3分鐘內）放進分光光度儀（325nm波長）檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品實際MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）

• 或構建細胞內活性氧生成曲線：縱座標（Y軸）為羥自由基活性氧吸光值（OD）；橫坐標（X軸）為組織量、蛋白量、時間點或藥物處理濃度等

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發，注意密閉
• 建議染色工作液現配現用為佳
• 孵育時，必須避免光照
• 建議使用新鮮樣品
• 建議使用石英或玻璃比色皿
• 本產品適合抗氧化能力檢測
• 用戶可以使用320至360nm之間的任一波長進行檢測
• 如果讀數大于1.5，可以使用萃取液（Reagent F）予以稀釋，但注意計算公式的稀釋倍數變化
• 本公司提供系列氧化應急活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

使用承諾

杰美基因秉著“信譽、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。

單組分訂購信息

編號 名稱 規格

GMS10124.3 細胞氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑盒 20次

GMS10124.3A 清理液（Reagent A） 毫升

GMS10124.3B  標記液（Reagent B） 毫升

GMS10124.3C  酸性液（Reagent C） 毫升

GMS10124.3D 染色液（Reagent D） 瓶

GMS10124.3E  終止液（Reagent E） 毫升

GMS10124.3F  萃取液（Reagent F） 毫升

GMS10124.3G  標準液（Reagent G） 毫升