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                  Interleukin 6（IL-6）
       Interleukin 6（IL-6） mRNA原位雜交試劑盒
 
產品編號：QY-10045
保存：置４℃。
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：人、大鼠 。
試劑盒中內容
    1.Interleukin 6（IL-6）   寡核苷酸探針雜交液       2ml；
  2.預雜交液                     2ml；
  3.胃蛋白酶（×10;Pepsin）      2ml；
  4.封閉液                       5ml；
  5.化鼠抗地高xin          5ml；
  6.SABC-POD                     5ml；
  7.化過氧化物酶           5ml。
用戶自備試劑：原位雜交蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液（3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 原位雜交用PBS ）
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液： 4% 多聚甲醛 /0.1 M PBS （PH7.2-7.6 ）； 1% 多聚甲醛 /0.1 M
PBS （ PH7.2-7.6 ） 3% 檸 檬 酸 — — 100ml 蒸 餾 水 中 加 檸 檬 酸
（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉17.6g，
檸檬酸三鈉（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。 0.5×SSC——300ml 蒸餾水
加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸餾水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油
——20ml 甘油加 80ml 蒸餾水即可。原位雜交用 PBS——0.02M phosphate ；
0.5M NaCl(1000ml  蒸餾水加氯化鈉 30g,Na2HPO4·12H2O6g,  NaH2PO4·2H2O
0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序： 注意：zui重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC 處理，
以抑制RNA 酶對mRNA 的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利
影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所
用培養基為
Dulbecco 基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分鐘×3 次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為 4%多聚甲醛/0.1 M
PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定20--30 分鐘。蒸餾水充分洗滌
干燥后-20℃冰凍可保存2 周以2
上。
4．30%H2O2 1 份+純甲醇50 份混合，室溫處理30 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
5．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%
檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化5—120 秒鐘。有時也
可以不消化。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-
7.6），含有1/1000DEPC。室溫固定10 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
7. 預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml 以保持濕度。按每
張切片20μι
加預雜交液。恒溫箱38-42 2—4  ℃ 小時。吸取多余液體，不洗。
8. 雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交蓋玻片的保
護膜揭開后，
蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9.  雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的 2×SSC 洗滌 5 分鐘×2 次；
37 0.5×SSC  ℃ 洗滌15 分鐘×1 次; 37 0.2×SSC  ℃ 洗滌15 分鐘×1 次(如果有非特異
性染色，重復0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1-2 次)。
10.滴加封閉液：37 30  ℃ 分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加化鼠抗地高xin：37  60  ℃ 分鐘或室溫120 分鐘。原位雜交用PBS 洗
5 分鐘×4 次。
勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37 20  ℃ 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×3 次。勿
用其它緩沖液
和蒸餾水洗滌。
13.滴加化過氧化物酶：37 20  ℃ 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5
分鐘×4 次。
14.DAB 顯色：使用DAB 顯色試劑盒—1ml 蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C 各一滴，
混勻，加至標本上。一般顯色20-30 分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配
DAB 顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定
液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。標本較大時用
刀片切成厚度不超過4mm 的小塊，固定1 小時即可，較大的標本固定不要超過
2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間 30-40 分鐘，一
般不要超過1 小時。
1． 常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2． 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3． 石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1 份+蒸餾水10 份混合,室溫5-10 分鐘
以滅活內源性酶。蒸餾水洗3 次。
4．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%
檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30 分鐘（視標本
新舊、厚薄自行調整）。用戶可以比較不同的消化時間，例如5 分鐘,10 分鐘，203
分鐘，30 分鐘。以找到*的消化時間。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水
洗1 次。其余步驟和冰凍切片6-16 步相同。
結果觀察：il-6mRNA 的細胞胞漿著色呈棕黃色。
原位雜交的注意事項
原位雜交成套試劑盒，由于采用標記的探針和敏感性加強型原位雜交檢測
試劑盒；使得原位雜交實驗的成功率大大提高，操作也更簡便。 但仍有一些問題
是引起注意的；
1、有條件應盡可能用新鮮標本，并及時進行固定。固定液為 4%多聚甲醛
(0.1MPBS，PH7.0-7.6)含0.1%DEPC。因為mRNA類基因容易降解。
2、標本的消化對原位雜交比較重要，適當的消化將使靶基因充分暴露，增加探
針的接觸性。但過度的消化將使標本明顯減薄乃至消失。不同的標本對消化的敏
感性不同。 常用的消化酶有蛋白酶K和胃蛋白酶。大量標本實驗前，應仔細摸索
*的消化條件。蛋白酶K的消化條件為10ug/mL(0.1M TBS,PH7.2-7.6)，37℃
消化1-5分鐘。
3、雜交后的洗滌對信號/背景/強度有密切關系，洗滌時間越短，信號越強，背景
也越高；洗滌時間超長，信號越低。適當的洗滌時間會獲得理想的信號強度和可
以忽略的背景染色。