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微量DNA 提取試劑盒說明書-齊一生物

時間:2018/10/23閱讀:1207
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微量樣品基因組 DNA 提取試劑盒

(Micro DNA Kit)

For Research Use only

僅供研究用

貨號:QY312

20T/50T/100T

產品簡介:

本試劑盒采用可以特異性結合核酸的離心吸附柱和*的緩沖液系統,樣品裂解后,DNA在高鹽條件下與硅膠膜結合,在低鹽、高pH值時DNA從硅膠膜上洗脫下來。

本試劑盒用于從小劑量的血液、干血點等微量樣品中提取基因組DNA,所得基因組DNA可直接用作PCR模板、酶切、雜交等分子生物學實驗。

 

儲存條件:置于室溫(15–25℃)干燥條件下,可保存 12 個月,更長時間的保存可置于 2–8℃。

注意事項:請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項

1. 樣品應避免反復凍融,否則會導致提取的 DNA 片段較小且提取量也下降。

2. 若緩沖液 A 或緩沖液 B 中有沉淀,可在 56℃水浴中重新溶解。

3. 所有的樣品使用前請平衡到室溫(15–25℃)。

4. 次使用試劑盒時,請按照試劑瓶上的提示在漂洗液 W2 中添加無水乙醇。

所有離心步驟均使用臺式離心機,室溫下離心。

一、從少量血中提取基因組 DNA 操作步驟:

1. 10–100 µl 血液到 1.5 ml 的離心管中。加緩沖液 A 到 100 µl 終體積。加10 µl 的蛋白酶 K 溶液。

注意:如果需要去除 RNA,可加入 5µl RNase A (100mg/ml) 溶液(目錄號:ZS103),振蕩 15 秒,室溫放置 5 分鐘。

2. 加入 100 µl 的緩沖液 B 和 5ul Acryl Carrier,渦旋振蕩 1-3 秒,混勻即可。簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。56℃溫浴 10 分鐘。

注意:加入緩沖液 B 時可能會產生白色沉淀,一般 56℃放置時會消失,不會影響后續實驗。如溶液未變清亮,說明細胞裂解不*,可能導致提取 DNA 量少和提取出的 DNA 不純。

  • 加入 100 µl 乙醇(96100%,如果室溫超過 25℃,請將乙醇置冰上預冷。渦旋振蕩 20 秒。簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。將所得溶液都加到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
  • 向吸附柱中加入 500 µl 緩沖液 C,12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
  • 向吸附柱中加入 600 µl  漂洗液 W2(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。重復此步聚一次
  • 將吸附柱放入收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 分鐘,倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液

注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR 等)實驗。

  • 將吸附柱轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加 30–50 µl 洗脫緩沖液 TE, 室溫放置 2–5 分鐘,12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 分鐘, 將溶液收集到離心管中。

注意:洗脫緩沖液體積不應少于 30 μl,體積過小影響回收效率。為增加基因組

DNA 的得率,可將離心得到的溶液再次加入吸附柱中,室溫放置 2 分鐘,12,000

rpm(~13,400×g)離心 2 分鐘。

洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其 pH 值在7.0-8.5 范圍內(可以用 NaOH 將水的 pH 值調到此范圍),pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率;且 DNA 產物應保存在-20℃,以防 DNA 降解。

二、從干血點中提取基因組 DNA 操作步驟:

1. 取三片 3×3 mm 的樣品到 1.5 ml 的離心管中。加入 180 µl 的緩沖液 A。加入10 µl 蛋白酶 K 溶液,輕輕顛倒混勻。56℃孵育 30 分鐘。

2 . 加入 200 µl 的緩沖液 B 和 5ul Acryl Carrier,渦旋振蕩 1-3 秒,混勻即可。

70℃孵育 10 分鐘,簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。

注意:加入緩沖液 B 時可能會產生白色沉淀,一般 70℃放置時會消失,不會影響后續實驗。如溶液未變清亮,說明細胞裂解不*,可能導致提取 DNA 量少和提取出的 DNA 不純。

3. 加入 200 µl 的乙醇(96100%。如果室溫超過 25℃,請將乙醇置冰上預冷。渦旋振蕩 20 秒。簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。

4. 將上一步所得溶液都加到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中12,000  rpm

(~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

  • 向吸附柱中加入 500 µl 緩沖液 C,12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中
  • 向吸附柱中加入 700  µl  漂洗液 W2(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。重復此步聚一次。

7. 將吸附柱放回廢液收集管中,12,000 rpm (~13,400×g)離心 2 分鐘,倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR 等)實驗。

8. 將吸附柱轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加 30–50 µl 洗脫緩沖液 TE, 室溫放置 2–5 分鐘,12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 分鐘,將溶液收集到離心管中。

注意:洗脫緩沖液體積不應少于 30 μl,體積過小影響回收效率。為增加基因組

DNA 的得率,可將離心得到的溶液再次加入吸附柱中,室溫放置2 分鐘,12,000

rpm(~13,400×g)離心 2 分鐘。

洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其 pH 值在7.0-8.5 范圍內(可以用 NaOH 將水的 pH 值調到此范圍),pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率;且 DNA 產物應保存在-20℃,以防 DNA 降解。

DNA 濃度及純度檢測

得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。

DNA 應在 OD260 處有顯著吸收峰, OD260 值為 1 相當于大約 50 µg/ml 雙鏈

DNA、40 µg/ml 單鏈 DNA。

OD260/OD280 比值應為 1.7-2.0 左右,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會偏低,因為 pH 值和離子存在會影響光吸收值,但并不表示純度低

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