質粒提取實驗方法

一、導論 
  　　已經提出過許多方法用于從細菌中提純質粒DNA， 這些方法都含有以下3個步驟： 
細菌培養物的生長。 
細菌的收獲和裂解 
質粒DNA的純化。  
 
（一）細菌培養物的生長  
從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養物中(有含有行當抗生素的液體培養基中生長)，然后從中純化質粒，質粒的提純幾乎總是如此。現在使用的許多質粒載體（如pUC系列）都能復制到很高的拷貝數，惟致只要將培養物放在標準LB 培養基中生長到對數晚期，就可以大量提純質粒。此時，不必造反性地擴增質粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復制，所以需要在得到部分生長的細菌培養物中加入氯霉素繼續培養若干小時，以便對質粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續復制，在若干小時內，其拷貝數持續遞增。這樣，像pBR３２２－類的質粒，從經氯霉素處理和未經處理的培養物中提取質粒的產量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質合成的氯霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。 
 
（二）細菌的收獲和裂解 
細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個因素：質粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際，但仍可據下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。 
1)大質粒(大于15kb)容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內部把質粒釋放出來所需要的作用力。 
2)可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢復正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。 
3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒DNA內污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質粒時，不宜使用煮沸法。 
4)當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：進行抽提)可以避免此問題。 
５)目前這一代質粒的拷貝數都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質粒DNA的產量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。 
 
(三)質粒DNA的純化  
常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多的染料，直至達到飽和( 每２個堿基對大約結合１個溴化乙錠分子) 。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質粒。另外，現在已可買到現成的純化KIT。 
 
二、質粒DNA的小量制備 
細菌的收獲和裂解 
收獲 
堿裂解法 
煮沸裂解 
質粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策  
質粒ＤＮＡ的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法 
 
（一）細菌的收獲和裂解 
１．收獲 
１）將2ml含相應抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養過夜。 
２）將1.5ml培養物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養物貯存于4℃。 
３）吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。 
 
２．堿裂解法 
１）將細菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 
10mmol/LEDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。 
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋） 
1%SDS 
蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內容物。應確保離心管的整個內表面 
均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 
３）加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ  
溶液Ⅲ 
5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml 
冰乙酸 11.5ml 
水 28.5ml 
所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。 
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后 
將管置于冰上３－５分鐘。 
４）用微量離心機于4℃12 000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。 
５）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機于4 ℃以12000g離心 
２分鐘，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為不*酚：進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應的DNA。 
６）用２倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置２分鐘。 
７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分鐘。 
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。 
９）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。 
i.此法制備的高拷貝數質粒（如Ｘf3或pUC），其產量一般約為：每毫升原細菌培養物3－5μg。 
ii．如果要通過限制酶切割反應來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。 
iii.此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養物 
 
３．煮沸裂解 
１）將細菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。 
STET 
0.1mol/L NaCL 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
5% Triton X-100 
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。 
３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。 
４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。 
５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。 
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。 
７）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。 
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。 
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。 
10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發殆盡，管內無可見的液體（2－5）分鐘。 
11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 
注：當從表達內切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能*滅活內切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時）質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：進行抽提，可以避免這一問題。 
 
（二）質粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策  
裂解和煮佛法都極其可靠，重復性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題： 
１）有些工作者進行小量制備時，有時會發現質粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數情況下，用酚：對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。 
２）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現無質粒DNA的現象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。  
 
三、質粒ＤＮＡ的大量制備 
在豐富培養基中擴增質粒 
細菌的收獲和裂解 
收獲 
堿裂解法 
 
（一）在豐富培養基中擴增質粒 
許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產量至每500ml培養物2－5mg質粒DNA，而且重復性也很好。 
１）將30ml含有目的質粒的細菌培養物培養到對數晚期（DNA 600約0.6)。培養基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。 
２）將含相應抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養基（預加溫至37℃）施放入25ml對數晚期的培養物，于37℃劇烈振搖培養25小時（搖床轉速300轉/分），所得培養物的OD 600值約為0.4。 
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒（如pUC質粒）可復制達到很高的拷貝數，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。 
４）于37℃劇烈振搖（300轉/分），繼續培養12-16小時。 
 
（二）細菌的收獲和裂解 
１．收獲 
１）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。 
２）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。 
STE 
0.1mol/L NaCl 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細菌細胞。 
２，堿裂解法 
 
１）將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
10mmol/L EDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。 
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。 
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋） 
1％SDS 
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。 
４）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。 
溶液Ⅲ 
5mol/L乙酸鉀 60ml 
冰乙酸 11.5ml 
水 28.5ml 
所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。 
封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質－膜復合物。 
５）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟４）]。 
６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。 
７）用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。 
８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮殆盡。 
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 
10）純化。 
四、質粒ＤＮＡ的純化 
聚乙二醇沉淀法質粒ＤＮＡ 
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環ＤＮＡ 
  
（一）聚乙二醇沉淀法提取質粒ＤＮＡ 
１）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于４℃下以10 000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。 
２）將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉頭（或與其相當的轉尖）于室溫以10 000轉/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。 
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使zui后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使zui后殘余的痕量乙醇蒸發殆盡。 
４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。 
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質粒ＤＮＡ。 
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：各抽１次。 
７）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒ＤＮＡ。 
８）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。 
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到zui后可見的痕量乙醇蒸發殆盡。 
10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)] 后測量OD 260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。 
  
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環ＤＮＡ 
此方法可獲的較高質量的質粒DNA，但耗時且費用昂貴目前較少采用，這里不多綴述。