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深入剖析!如何利用CRISPR技術編輯人類誘導多能干細胞?

時間:2016-9-12閱讀:700
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深入剖析!如何利用CRISPR技術編輯人類誘導多能干細胞?


過去10年里誕生了兩種非常有用的生物學工具,*個就是人類誘導多能干細胞(iPSCs),這是一項榮獲諾貝爾獎的*科技產物,2006年時研究者開始對小鼠進行實驗,隨后在人類機體中進行實驗,研究者表示他們有可能將成體的皮膚細胞轉化成為多能干細胞,隨后這些多能干細胞就能夠被誘導轉化成為任何類型的細胞,這些細胞是個體基因組在細胞尺度的化身,而且其可以幫助科學家開發出那些不能取自活體的細胞類型,ipsCs通常能夠提供方法來模仿單成因及復雜的人類疾病,同時還可以指導進行基于細胞的療法。
第二項工具就是CRISPR-Cas9系統,其能夠對基因組中的任何區域進行準確的編輯,當涉及傳統永生的細胞系,比如HeLa或HEK293細胞系時,利用CRISPR進行切割或許會作為一個新手讓研究者學習數周,第二波基于CRISPR的方法常常是通過增強或者減弱基因表達的水平來發揮作用的,而不是進行基因的切割,這或許可以使得這種方法變得更加有用。
上述兩種技術的結合或將帶來不可估量的效應,利用CRISPR編輯的iPSCs可以使得科學家對基因進行操作來研究在特殊疾病背景下的基因功能,或者去糾正病人細胞中的遺傳缺陷,而其中一種挑戰就是幫助定位的無縫基因編輯技術或許就能夠確定不同ipsC細胞系的遺傳變異,CRISPR-Cas9技術就能夠幫助科學家制造出新型的僅通過單個核苷酸改變且用作特殊個體的質控細胞。
盡管CRISPR-Cas9和人類iPSCs已經成為研究者在實驗室中老生常談的話題了,但對兩者進行統一卻并不容易,想要研究基因功能的科學家如今正在發現,在培養基中很難維持人類ipsCs,而且也很難利用CRISPR進行操作。
zui基本的工作流程
編輯且控制人類iPSCs細胞中的基因表達往往以兩條平行的工作流開始,首先就是保證多能細胞的可靠來源,其次就是設計導向RNA,即可以靶向作用基因且具有20個核苷酸的序列。為了利用導向RNA和Cas9核酸酶來轉染細胞,電穿孔技術就是主要的方法,因為其能夠幫助科學家在維持細胞活性的同時將大量的DNA及蛋白質輸入到細胞中,由于人類多能干細胞在運輸過程中會沉默基因的表達,因此就應當盡可能地避免慢病毒運輸。研究者通過追蹤細胞的形態、多潛能標志以及細胞分化的能力來評估細胞的多能性,核型分析技術通常就能夠確保細胞中有著正常數量的染色體,而且ipsC細胞系可以被用來廣泛購買。
人類多能干細胞VS人類腫瘤細胞系
首先研究者在人類癌細胞系中嘗試CRISPR-Cas9工具,當他們準備轉移到研究人類多能干細胞時,他們發現人類的iPSCs屬于勞動密集型分布,而且難以維持。來自哈佛醫學院的研究者Susan Byrne說道,有經驗的研究者常常會花費一個月時間來學習人類iPSC的基本培養技術,即使那樣,由于新步驟和試劑的出現,利用這些細胞進行研究仍然是一個需要持續學習的過程。干細胞非常特殊,其質量影響著我們培養細胞以及利用導向RNAs靶向作用細胞的能力,而我們看到的改變依賴于單一的供體及重編程的方法,有時候我們不得不優化制造特殊干細胞系的步驟。來自霍普金斯大學醫學院的研究者Linzhao Cheng說道,在一般情況下,甚至利用健康細胞系時,我們應當期望降低10倍效率來將對人類ipsCs和ESCs進行編輯。
開始了解我們的基因
研究者表示,我們應當研究基因位點并且理解這些序列的功能,比如,在基因編輯之后被干擾的基因仍然會表現出某些生物活性,在某些情況下我們應當考慮基因位點發生了雙重切割,而這目的是為了切除更大的基因區域。
選擇多種導向RNAs并且對其進行檢測,如今大量的軟件都能夠選擇導向RNAs,但我們要記住,特殊的導向RNA似乎并不能很好地進行工作,或者根本不會工作;來源于事實的一個非常簡單且zui容易被忽視的原因就是根據我們的向導設計我們或許并沒有相關的基因組,此外我們也應當需要考慮向導的活性。
敲除VS編輯
當利用CRISPR-Cas9切割基因時,兩個主要的分子途徑就會開啟來進行DNA修復,而且zui終會確定隨后編輯作用的保真性,這兩個修復通路同時會發生,用作基因敲除的非同源性末端接合(NHEJ)能夠在DNA中產生小型的插入位點或剔除位點來阻斷基因的功能;另外一種名為同源性直接修復(HDR)的作用則會基于供體的長鏈DNA來產生的核苷酸改變。
目前研究者Hockemeyer及其同事正在開發新型策略來使得同源性直接修復發揮主要作用,比如應用特殊的化學物或利用來自不同物種的Cas9酶等,研究者說道,我認為在未來幾年里我們解決這些問題指日可待。
研究者Conklin的團隊開發出了一種快速的數字PCR技術,其能夠對HDR和NHEJ的修復率進行定量,在包括人類ipsCs的多個細胞類型中,上述兩種修復率并沒有互相關聯,這就表明,相比單單測定一種修復率而言,同時測定兩種修復率是非常明智的,尤其是當目標是HDR的時候。
對切割進行特性描述
在細胞分化前和分化后,測定或者掌握細胞的表型,比如形狀或特殊標志物的存在,都是我們證實是否在合適位置切割的zui基本的方法,利用和待編輯基因互補的DNA來補充編輯的細胞或許能夠恢復細胞的表型,如果細胞表型太精細不能測出微小改變的話,研究者或許就應當嘗試對基因進行第二次編輯來將其恢復至野生型。
此外研究者還抽取了基因編輯的基因組進行調查,比如利用這些區域的PCR和Sanger測序結果等,一種名為TIDE的算法可以重建預期突變的身份,同時還能夠揭示其發生的機制。研究者Mali說道,對所有的蛋白編碼基因和外顯子組進行測序或許就能夠幫助挑選已經驗證的編輯,測序是當前的主要分析方法;從另一方面來講,隨著時間遺傳差異性會不斷積累,而這與細胞系并無關聯。
脫靶效應
一種抑制脫靶編輯的主要方法就是至少利用兩種或多種靶向作用相同位點的不同“向導”,而這或許并不可能給出相同的脫靶結果;一般而言,脫靶效應并不是主要的問題所在,至少對于大多數基礎科學家而言是這樣的,相比癌細胞系而言,脫靶效應往往并不太可能發生于人類的多能干細胞中,但研究者如果真得非常關心的話,進行全外顯子組測序或許就是的方法了。
控制基因的表達而不是對基因進行編輯
如果希望對多能干細胞中對多能性表現非常重要的基因進行敲除的話,很明顯我們的運氣并不夠好,我們或許并不能用死細胞得出太多信息,在這種情況下,我們就需要提高或減弱基因的表達,而擴大CRISPR-Cas9工具的功能或許就能達到這種目的;研究者們通常會使用一種“死亡版本”的Cas9,其能夠結合到基因組中的預定位置但并不會切割DNA序列,相反,死亡版本”Cas9的不同突變體要么會抑制轉錄(稱之為CRISPR干擾,CRISPRi),要么會激活表達。
近來一項研究發現,對ipsCs篩查尋找功能缺失區域時,相比CRISPR-Cas9而言,CRISPRi或許會比傳統的CRISPR更加有效,CRISPRi能夠沉默95%的細胞中的基因表達,而CRISPR-Cas9僅能夠沉默60%至70%細胞中基因的表達,這是因為CRISPR-Cas9并不總是會引發移碼突變,而移碼突變通常會使得蛋白質部分或*失去功能,也就是說,成功地沉默基因的表達往往因細胞類型和位點不同而不同。
基因表達控制和基因編輯之間的主要差異就是,在基因表達控制下,我們或許并不能*地改變基因組,我們可以擾亂細胞的功能,比如沉默基因表達隨后逆轉基因的抑制作用;此外,相比CRISPR-Cas9而言,脫靶效應或許更少地同CRISPRi和CRISPRa(CRISPR激活)相關。調節基因表達面臨的一個挑戰就是研究者很難選擇或設計一套堅實的導向RNAs,研究者表示,在理想狀況下他們可以避免基因組的區域被核小體緊密圍繞,而蛋白的纏繞往往會使得基因沉默,但在某些情況下,這些區域就很有可能是研究者所要靶向作用的區域。
對于研究者而言,將CRISPRi和CRISPRa有效成功地運輸到人類多能干細胞中非常復雜,研究者Cowen指出,目前除非使用病毒載體的運輸方法,否則仍然很難將CRISPRi和CRISPRa運輸到70%至80%的細胞中,而目前我們僅僅談論的是30%至40%的細胞,研究者認為這或許能給他們帶來一定幫助,因為在某些情況下他們很難或者不可能將ipsC分化成為特殊類型的細胞,研究者Cowen長期利用CRISPRa來激活并且驗證報道基因,他表示,在我們實驗室利用腎臟內皮細胞就能夠知道報道基因是否在正常工作。
 

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