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DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。 DNA 分子在高于等電點的 pH 溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由于糖 - 磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈 DNA 幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速度向正極移動。
制備瓊脂糖凝膠Sp Fungal DNA Midi Kit(25)
1 .稱 1. 2g 瓊脂糖,加 100ml 電泳緩沖液( 1×TAE )加熱熔化,取出搖勻,即為 1. 2% 的凝膠。
2. 當膠液冷至 60℃ 時,加 EB10μl ,小心混勻,緩慢倒入制膠模具中,在膠一端插上梳子。
3 .待膠凝固后,撥出梳子,將模具置于電泳槽中,加入 1×TAE ,讓液面高于膠面 2 -3mm 。
4 .取 4ul 質(zhì)粒,加 2ul lodaing buffer , 6ulddH 2 O ,混勻,用加樣器吸取樣品。加入點樣孔中,注意加樣器吸頭應恰好置于凝膠點樣孔中,不可刺穿凝膠,也要防止將樣品溢出孔外。
5 .接通電源, 1-5V/cm 電壓,開始電泳。Sp Fungal DNA Midi Kit(25)
6 .當溴酚蘭染料移動到距離膠前沿 1 -50px 處,停止電泳。
7. 切斷電源后,取出凝膠,在紫外燈( 360nm 、 312nm 或 254nm )下或經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察或拍照。
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 與線性染色體 DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在 pH 值介于 12. 0-12. 5 這個狹窄的范圍內(nèi),線性的 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入 Ph4. 8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復 pH 至中性時,共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,而線性的染色體 DNA 的兩條互補鏈彼此已*分開,復性就不會那么迅速而準確,它們纏繞成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過離心,染色體 DNA 與不穩(wěn)定的大分子 RNA 、蛋白質(zhì) -SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。
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