Western Blot 免疫印跡法 主要步驟

主要包括以下 4 個基本步驟：樣品制備；電泳分離；蛋白的膜轉(zhuǎn)移；免疫雜交與顯色――蛋白檢測。

溶液和試劑


1. 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)


2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA:1 mM ;PMSF: 1 mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM;NaF: 1 mM


3. 1X SDS 樣品緩沖液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚藍


4. 轉(zhuǎn)移緩沖液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)


5. 10X Tris緩沖鹽 (TBS)：準備1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl調(diào)pH為 7.6


6.甲醇


7. TBS/T緩沖液：1X TBS, 0.1% Tween-20


8. 封閉緩沖液（TBS/T）：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v 脫脂奶粉或BSA


9. 一抗的稀釋：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脫脂奶粉( 單抗)。Note： 一般來說，BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。預染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率。

樣品制備


原始樣品可為細胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。


1．培養(yǎng)細胞或藥物處理。


2．棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。


3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落細胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。


4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。


5．煮沸樣品5 minutes。


6．離心12000g，5 min，取上清。


7．電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測某蛋白的表達水平， 應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。


注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。

電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法） 轉(zhuǎn)膜


雜交膜的選擇是決定 Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn) 移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起， 但在非離子型的去污劑作用 下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔 徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。 通常用 0.45μm 和 0.2μm 兩種規(guī)格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2μ m 的膜了， 如用0.45μm 的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低 分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。


蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易， 轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的 操作步驟。


1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。 注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。


2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。


3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治： 海綿 3 層濾紙 膠 膜 3 層濾紙 海綿， 每層放好后， 用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。


4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。


5. 轉(zhuǎn)膜結束后，切斷電源，取出雜交膜

免疫雜交與顯色

1．用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。

2．置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。

3．15mlTBS/T洗3次（5 min/T）。

4．加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。

5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

6．加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。

7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

8．15 ml TBS洗1次。

9．蛋白檢測( 顯色法或發(fā)光法，按相應試劑說明操作) 。

注意事項：

1．操作中戴手套，不要用手觸膜。

2．PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。

3．如檢測小于20kD的蛋白應用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。

4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。

5．關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源xing交叉反應性。

6．如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。

7．如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，用梯度膠分離蛋白。