（1）選擇合適的超濾管。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同。

（2）新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水，水量*過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

（3）平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至zui低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機(jī)，否則離心機(jī)出問題時，無法*時間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。

（4）當(dāng)濃縮到剩下1ml時，取50ul緩沖溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。

（5）前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，zui后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。

離心濃縮管

pall離心濃縮管可以有效簡化核酸與蛋白的常規(guī)處理程序。只需幾分鐘，這些離心管就可以對從50ul到60ml的樣品進(jìn)行的濃縮和脫鹽。它可選配多種膜，確保低非特異性生物分子吸附和穩(wěn)定的高回收率，回收率通常超過90%。

1、三種常用的應(yīng)用：

●濃縮——采用超濾的方法濃縮稀釋的蛋白或DNA/RNA樣品溶液是十分便捷的

●脫鹽和緩沖液交換（洗濾）——超濾為去除和更好溶液中的鹽、去除變性劑、分離復(fù)合分子、去除低分子量物質(zhì)或者快速改變離子或者pH環(huán)境提供了方便而的方法。

●分離-超濾無法*分離兩種分子量近似的分子。為有效分離，被分離分子的分子量差別至少要達(dá)到一個數(shù)量級（10X）。使用超濾進(jìn)行分離非常，比如制備無蛋白的濾液，從DNA和蛋白樣品上分離游離狀態(tài)或者未混合的標(biāo)記物，純化PCR合成反應(yīng)的產(chǎn)品。

2、與非膜工藝（層析、透析、溶劑萃取或者離心）相比，超濾具有以下優(yōu)點(diǎn)：

●對于被處理的分子更加溫和

●不需要有機(jī)萃取，也就不會導(dǎo)致蛋白變性

●維持了離子和pH條件

●更快，更便宜

●可以在低溫下進(jìn)行處理（比如在冷藏室中）

●，可以同時對分子進(jìn)行濃縮和純化

3、基于不同處理量的產(chǎn)品的選型