whatman 3MM濾紙的應(yīng)用---雜交篩選——cDNA序列作為探針

1．如上述將文庫鋪平板，噬菌斑雜交實驗用E.coli宿主菌株Y1088。

2．噬菌斑于42℃生長過夜。

3．從溫箱取出平板，置4℃冷卻至少1h。

4．膜剝離：首先，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上給準(zhǔn)備影印的平板編號。其次，從平板的中央開始向邊緣小心將濾膜鋪在菌臺上。當(dāng)濾膜*變濕后（顏色變灰），再等30s。同時，用針頭在平板上標(biāo)出濾膜的3個不對稱位置。小心將濾膜從平板上剝離，接觸面向上放在一張干凈的Whatman 3MM濾紙上。在進(jìn)行下一步驟之前，所有的平板重復(fù)步驟4。

5．將濾膜接觸面向上漂浮在變性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/LNaCl）中5min。

6．中和5min。

7．用2×SSC洗滌5min。

8．將濾膜放在一張新的Whatman3MM濾紙上，用鉛箔將濾膜和濾紙一起包住。

9．在真空爐中80℃烘烤2h。

10．用6×SSC預(yù)先短暫地濕潤濾膜，然后用預(yù)洗液（50 mmol/LTris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1%SDS）于68℃預(yù)洗滌至少1h。用一個盤子放在水浴搖床上。

11．將25張濾膜轉(zhuǎn)移到一個裝有50ml雜交液（5×SSPE；1×Denhardt's液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的貯存罐內(nèi)（直徑至少90mm），68℃預(yù)雜交2h。

12．對于每ml雜交液，2倍的105至1×106cpm的雙鏈探針經(jīng)沸水浴變性10min后，迅速放冰上冷卻。

13．變性探針立即加到預(yù)雜交混合液中。

14．在封口的貯存罐內(nèi)于68℃雜交過夜，不斷地晃動以防濾膜粘在一起。

15．雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC，0.01％SDS于室溫洗滌3次約1h。

16．將潮濕（防止干燥）的硝酸纖維素濾膜放在一張硬紙或X光片上，用放射性墨水在針頭標(biāo)簽上作標(biāo)記。

17．濾膜用塑料包裝袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光過夜。