RNA制備中常見問題和解答

1、塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

(a)塑料制品：盡可能使用無菌,一次性塑料制品.已標(biāo)明RNase-Free 的塑料制品,如沒有開封使用過,通常沒有必要再次處理.對于國產(chǎn)塑料制品,原則上都必須處理方可使用.處理方法如下：

(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%.注意：DEPC為劇毒物,活性很強,小心在通風(fēng)柜中使用.

(2)將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.

(3)在通風(fēng)柜中室溫處理過夜.

(4)將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中,用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯,高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘.

(5)烘箱用合適的溫度烘拷至干燥.置于干凈處備用.

(b)玻璃和金屬物品

250°C烘烤3小時以上.

2、RNase 是RNA制備的殺手

答：RNase酶非常穩(wěn)定,是導(dǎo)致RNA降解zui主要的物質(zhì).它在一些的條件可以暫時失活,但限制因素去除后有迅速復(fù)性.用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase*失活.它廣泛存在于人的皮膚上,因此,在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時,必須戴手套.RNase的又一污染源是取液器.根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理.一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部,基本達(dá)到要求.取 RNase-free的物品時必須戴手套.

3、采用什么方式純化總RNA？

答：我們提供多種RNA純化方式,根據(jù)您對RNA純化技術(shù)的熟悉程度,選用不同的純化手段.從產(chǎn)品使用效果看,基于TriBlue的一步法分離總RNA試劑盒（K311,K321系列）無論是新手還熟手都可以得到比較理想的結(jié)果.如果您對苯酚過敏,出于對環(huán)境的保護(hù),您可以選用整個分離流程都不使用苯酚的試劑盒（K361系列）.從產(chǎn)品形式上,我們的總RNA分離分醇沉淀離心式和離心吸附柱方式兩種.沉淀方式總的產(chǎn)量比較高,純化規(guī)模機動,但是純度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比較簡單,純度高,受吸附容量的影響,產(chǎn)量收到影響.

4、什么時候需要分離mRNA?

答：常規(guī)RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的,一般都可以采用總RNA作為RT-PCR 的模板,但是做cDNA文庫,克隆豐度極低的基因,大多數(shù)DD-PCR, 削減雜交等需要純化的mRNA.一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶連oligo (dT),從組織或總RNA種直接分離mRNA.

5、如何判定分離的總RNA的純度？

答：需要從兩個方面著手,缺一不可,特別是新手（1）測定OD260/OD280的比值,測定時,RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀釋.理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之間.比值如果過低,可能有蛋白質(zhì)污染,過高RNA可能已發(fā)生降解.（2）瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強度.變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng),不可以采用DNA 電泳用的TBE或TAE系統(tǒng).如果OD260/OD280過低（<1.7）,通常可以通過減少組織和細(xì)胞的用量來實現(xiàn).

6、什么時候需要加入RNA-Carrier?

答：樣品很少或樣品中RNA含量低,制備RNA時需要加入一定的 RNA載體,以提高RNA純化的得率.常用的載體有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen.一定濃度范圍的 Carrier對一些RNA的下游應(yīng)用沒有影響,如RT-PCR, Northern Blot.

7、如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?

答：無論用種方式制備的總RNA,要保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實的.如果您希望得到DNA free 的RNA樣品,需要用RNase free的DNase I處理.

8、純化的RNA樣品如何保存？

答：如果希望得到*的結(jié)果,純化的RNA需要立即用于下游實驗.RNA可以保存在-80C冰箱,長期保存可以置于液氮中.如果沒有-80冰箱或液氮,RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中,-20度保存.

9、組織和細(xì)胞樣品如何收集,保存？

答：組織樣品收集后,需要立即保存在液氮中,或在樣品中加入一定量的保護(hù)劑,有一些商業(yè)化的產(chǎn)品可以選用.一般實驗收集50-100mg組織就足夠了.

10、如何估計RNA的產(chǎn)量？

答：能計算出RNA的產(chǎn)量,通常都是有比較多的起材料,但是很多情況下能夠取得材料很少,所制備得到的RNA無法通過分光光度的方法測定含量和濃度.RNA的含量與組織和細(xì)胞的類型有比較大的關(guān)系, 同時與抽提的方式有關(guān),例如用抽提小鼠組織100mg 肝可以得到500ug總RNA, 100mg肺 得到200ug總RNA, 1百萬個細(xì)胞Hela細(xì)胞可以得到15ug左右的總RNA. mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%.根據(jù)這樣一些經(jīng)驗值,估算出您可能得到的量.樣品如果低于20mg或10000個細(xì)胞,在抽提時需要考慮加入合適的RNA沉淀載體.

11、RNA制備過程中那個環(huán)節(jié)要特別注意？

答：一般情況下,細(xì)胞和組織在RNA抽提液中都可以保存一段時間,因為幾乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氰酸胍等強變性劑, RNase基本是不起作用的,操作即使是粗放一些,也沒有多達(dá)關(guān)系.但是通常是離心后取上清,這時候RNA已沒有保護(hù),操作要特別小心.