研究目的

轉錄組是指在一個生物體中所有基因表達后產物的總和，是功能基因組研究的一個重要功能指標。基于新一代測序的動植物轉錄組學研究可以在RNA水平研究動植物性狀、組織特異性的生理學過程，了解動植物的發育過程中的分子機制以及對外界環境的適應和進化的機制，并為動植物疾病預防或遺傳育種的分子標記開發提供理論依據。

研究對象

動植物不同發育階段、不同物種或相同物種的不同組織器官、不同外界環境刺激或不同生理狀況的動植物的轉錄組差異檢測與分析。

新一代測序方案
lncRNA-seq（ 長非編碼RNA 測序）

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度在200nt以上，起初被認為是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具有生物學功能。zui近幾年的研究表明lncRNA具有保守的二級結構，可以與蛋白質、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控，如染色質修飾、轉錄激活和抑制、轉錄后調控以及作為miRNA的誘導分子干擾基因的表達等， 因此lncRNA是一片非常廣闊的未知領域，具有*的研究價值和意義。通過rRNA去除的方法，富集lncRNA和mRNA建庫測序，可分析lncRNA和mRNA的表達情況，并發現大量新lncRNA及mRNA。
*數據量：10G
polyA-seq （mRNA測序）

通過polyA尾抓取mRNA建庫測序，檢測mRNA的差異表達或結構變異，篩選與疾病或性狀相關的分子標記。轉錄組測序可揭示轉錄組的復雜性，確定基因以及轉錄本結構、可變剪接、RNA編輯、帶polyA尾的非編碼RNA和新轉錄本。
*數據量：5G
基因表達譜測序(升級版DGE)

采用轉錄組測序（RNA-seq）建庫，直接對某一物種或特定細胞在特定功能狀態下產生的mRNA進行高通量測序的方法，已被廣泛應用于基礎科學研究、疾病機理、生物標記和藥物研發等領域。相對而言DGE更適合用于比較基因表達，無偏性，對于細胞生物的轉錄表達譜更為敏感和準確。RNA-seq和DGE兩種方法結合，對于無參考基因組或基因組較大且復雜的物種，可以有效地發掘新的功能基因。
*數據量：10M reads
Small RNA-seq （小RNA測序）

Small RNA是生物體內一類重要的非編碼小分子RNA，長度20-30個核苷酸，主要包含miRNA、 piRNA、siRNA、snoRNA等RNA分子。Small RNA參與基因表達與調控、RNA的加工與剪切、蛋白質翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發生等生物學過程。

微小RNA(microRNA, 簡稱miRNA)，是small RNA中的主要成分, 在進化上高度保守, 可通過識別靶mRNA 實現

轉錄后的基因調控。piRNA(PIWI-interacting RNA)是一類新型的非編碼小分子RNA，與PIWI蛋白相互作用，長度約26～32個核苷酸，其作用與Dicer酶無關。piRNA在生殖細胞的發育、轉座子沉默、減數分裂和精子發生等過程中具有多種生物學功能，另外piRNA還能通過調控編碼蛋白基因的甲基化修飾影響神經細胞的記憶功能。如果piRNA研究趨勢與microRNAs相似的話，那么可以預見piRNA無疑將一輪新的研究熱潮。
*數據量：10M reads

案例解讀

轉錄組測序研究胚胎發育過程lncRNA的作用(Andrea Pauli et al., Genome Research. 2012)

背景：lncRNA是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA能夠與修飾組蛋白的蛋白復合體相互作用并影響其活性，從而控制基因的活化狀態（可激活、激活或抑制），是胚胎發育過程*的調節子。本文系統報道了脊椎動物胚胎的lncRNA表達圖譜，為以后的遺傳學、基因組學和進化研究提供了基礎。

選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對象，在受精后的不同時期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內完成收集。

    選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對象，在受精后的不同時期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內完成收集。測序方法：采用polyA尾富集的方法進行RNA測序，平均測序數據量為200-300M reads，鑒定了胚胎發育過程中相關的lncRNA和mRNA。

結果：獲得斑馬魚不同發育時間點的lncRNA表達圖譜

1. 斑馬魚不同時間點的發育圖譜

圖2. 斑馬魚發育取樣時期。

2. 斑馬魚lncRNA功能分析

對鑒定的835個lncRNA基因座和mRNA進行共表達分析，共表達結果進行GO分析，zui重要的10個GO中，主要與信號通路（簇2）、發育（簇6）和細胞周期（簇8）相關，簇4-7幾乎都與發育功能相關，說明胚胎中的lncRNA可能發揮發育調控的作用，見圖3。對幾個重要的lncRNA進行原位雜交驗證，發現不同的lncRNA在不同的發育時期的表達情況，在二細胞期、肌肉和神經組織中都有特異性表達，見圖4。

圖3. lncRNA與mRNA共表達分析，行表示lncRNA，列表是功能基因，紅色表示正相關，藍色表示負相關，白色表示不相關。

圖4. lncRNA組織特異性原位雜交，對GO分析中重要的lncRNA進行原位雜交，顯示相應lncRNA在二細胞期、肌肉和神經組織的特異性表達。