原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué) （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 簡(jiǎn)稱原位雜交（In Situ Hybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針，zui后通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交zui初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位素標(biāo)記（如₃₅S，³H，³²P等）仍然廣泛使用，但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展（尤其是*標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針），更引起科技工作者的極大興趣。

一、基本要求

組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞在30min內(nèi)固定。

固定目的是：

（1）保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；

（2）zui大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；

（3）使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。

zui常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。

增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性：

（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過(guò)乙酰化而被阻斷。組織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2M HCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，zui常應(yīng)用的去污劑是Triton X-100。注意：過(guò)度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會(huì)引起靶核酸的丟失。

（3） 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對(duì)靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），還有*（pronase）和*（pepsin）等。

雜交緩沖液孵育：

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。

防止污染：

由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤（180℃）以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。

雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：

雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交（包括檢測(cè)RNA時(shí)），雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。

雜交液：

雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA:RNA，RNA:DNA，DNA:DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過(guò)高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的（尤其對(duì)雙鏈核酸探針）。在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。

探針的濃度：

探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同，一般為0.5-5.0μg/ml（0.5-5.0ng/μl）。zui適宜的探針濃度要通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能確定。

探針的長(zhǎng)度：

一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間，zui長(zhǎng)不宜超過(guò)400個(gè)堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。

二、試劑準(zhǔn)備

1． 0.1M PBS （pH7.2）：Na₂HPO₄•12 H₂O 61.6g、NaH₂PO₄•2 H₂O 5.6g、NaCl 9g，加ddH₂O至2000ml，高壓滅菌。

2． 0.2M PB （（pH7.2）：Na₂HPO₄•12 H₂O 61.6g、NaH₂PO₄•2 H₂O 5.6g 加ddH₂O至1000ml，高壓滅菌。

3． 0.1M*：0.75g*溶于0.1M PBS，定容至100ml，高壓滅菌。

4． 4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O 400ml，加熱至70℃左右，用1M NaOH調(diào)pH至7.0，用ddH2O定容至500ml，再加0.2M PB 
500ml，總體積為1000ml。

5． 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4g、聚蔗糖0.4g，加dd H2O至10ml，無(wú)菌抽濾、分裝， -20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

6．預(yù)雜交液：去離子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl（pH 8.0） 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA（pH 8.0） 0.04ml、0.1M二硫蘇糖醇 2 ml、ddH2O 2.21ml，總體積為10ml。無(wú)菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前加入50mg/ml變性鮭魚(yú)精DNA 75μl/ml。

7． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加水至800ml，用2N NaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。

8．抗體稀釋液：Triton X-100 80μl、BSA 0.2g，以0.05M PBS定容至20ml。

9． 
TSM1：1M Tris-HCl（pH 8.0）10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O 100ml。
   
TSM2（新鮮配制）：1M Tris-HCl（pH 9.5）10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O至100ml。

顯色液（臨用前現(xiàn)配）：5ml TSM2 加顯色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24μg/ml，避光。

三、操作步驟

（一）取材、冰凍切片：

將動(dòng)物以3%戊*鈉麻醉，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動(dòng)物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見(jiàn)圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。

（二）探針制備與檢測(cè)（定量）：

1．隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標(biāo)記檢測(cè)試劑盒為例：

（1）探針制備：

①模板DNA（0.5-3μg） 15μl，100℃變性10min，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl， dNTPmix 2μl，Klenow Enzyme 1μl，反應(yīng)總體積為20μl。37℃孵育過(guò)夜。

③在上述20μl的標(biāo)記產(chǎn)物中加4M LiCl 2.5μl，75μl（無(wú)水乙醇預(yù)冷，輕輕混勻，-20℃放置 2hr。4℃離心12000g×15min，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷） 50μl洗滌，7500g×5min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（2）探針敏感性檢測(cè)：

①樣品稀釋：取dig-標(biāo)記探針1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀釋。

②取一張與點(diǎn)樣器大小相近的尼龍膜，標(biāo)記方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置點(diǎn)樣器上，負(fù)壓抽吸5min。

③將上述樣品點(diǎn)于尼龍膜上，繼續(xù)抽吸10min。

④取下尼龍膜，置紫外燈下10cm處照射5min，晾干。

⑤將膜置于適量預(yù)雜交液（5-10 ml）中，37℃預(yù)雜交10min。

⑥加入Anti-dig 抗體（1:5000），37℃雜交30min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。

⑧顯色：15 mlTSM2中加300μl顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30min。

1． PCR法制備cDNA核酸探針：

（１）探針制備：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：

在0.5ml離心管中，依次加入：

PCR引物 1（10pM） 2μl；

PCR引物 1（10pM） 2μl；

質(zhì)粒DNA 模板（10-100pg） 2μl；

PCR DIG mix 2μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）；

dNTPmix 2μl；

10×PCR buffer 5μl；

Taq 酶（2u/μl） 1μl；

加入適量ddH2O，使總體積達(dá)50μl。

①將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。

一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃保溫7min。

②在上述PCR產(chǎn)物中加入4M LiCl 12.5μl、預(yù)冷無(wú)水乙醇375μl，輕輕混合后置于-20℃2hr, 12,000g×15min，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷） 120μl洗滌沉淀，離心7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（2）探針檢測(cè)：

行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測(cè)法）。

（三）原位雜交反應(yīng)（以DIG-cDNA探針為例）：

1．0.1M PBS （pH 7.2） 浸 5-10min。

2．0.1M*/0.1M PBS 浸5min。

3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。

4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K（1μg/ml），37℃孵育30 min。

5． 4%多聚甲醛浸5min。

6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。

7．預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液，42℃ 30 min。

<1>．雜交：傾去預(yù)雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?/span>42℃過(guò)夜。

<2>．洗片：

（1） 
4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；

0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；

0.05M PBS 洗 5min×2次。

10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min。

11．滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。

12．0.05M PBS洗15min×4次；TSM1 10min×2次；新鮮配制TSM2 10min×2次。

13．顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過(guò)夜。

14．將玻片置于TE中10-30min以終止反應(yīng)。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹(shù)膠封片。

15．顯微鏡下觀察結(jié)果。

四、注意事項(xiàng)：

1.作為DNA-RNA的雜交，需防RNase的污染。

2.cDNA探針在雜交時(shí)必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5min，冰浴驟冷。