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一、核酸電泳
二、雜交技術
三、PCR技術
四、基因芯片 一、核 酸 電 泳 （一）DNA的凝膠電泳
凝膠電泳是分子克隆的中心技術之一。 1、瓊脂糖凝膠用于分離大于200～1000bp的片段;
操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2、聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;
效果好、分辨率*，相差1bp的DNA。片斷就能分開，能容納相對大量的DNA
用于核苷酸多態性的分析 瓊脂糖凝膠電泳的基本過程
材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統、直流電源系統。
基本過程：制膠→放入電泳槽中并加入電泳緩沖液→取出梳子→將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中→一定電壓條件下電泳→合適的時間后停止電泳→取出凝膠進行溴化乙錠染色→凝膠成像系統紫外燈下觀察并照相保存結果。
注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套。不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 影響DNA在凝膠中遷移速率的因素
1 DNA分子的大小
2 構象
3 凝膠濃度
4 電壓
5 緩沖液 特殊的凝膠電泳
倒轉電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量10～2000kb的DNA分子；
鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子 （二）RNA 電 泳 基本過程同DNA電泳一樣，但應明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因為RNA分子有二、三級結構可以影響其電泳結果，因此電泳時應在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 二 核酸雜交技術 （一）Southern Blot 原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。 Southern Blot 操作步驟： DNA →瓊脂糖電泳→印跡轉移→預雜交→雜交（變性探針）→洗膜→放射自顯影或顯色 （二）Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRNA）及其含量。 操作過程 mRNA提取→甲醛變性電泳→印跡轉移→預雜交 雜交（變性探針）→洗膜→放射自顯影或化學發光 （三）探針標記技術 1、標記物：放射性和非放射性兩種 放射性： 非放射性：*、地高辛素、熒光素 2、標記方法 （1）切口平移法 （2）隨機引物法 （3）末端標記法 （4）單鏈DNA探針標記 （5）寡核苷酸探針標記法 三 PCR技術 （一）PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環，使目的DNA。片段得到擴增。由于這種擴增產物是以指數形式積累的，經25－30個循環后，擴增倍數可達106。
Dr. Karry Mullis 1985年發明，獲1993年度諾貝爾化學獎； （二）基本要素 1、Taq DNA聚合酶： 水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’→3’DNA聚合酶活性；
②無3’→5’外切酶活性， 35輪0.25%錯配，與原始模板有差別； zui適聚合酶 溫度72℃，選擇72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃ 5―6min
變性溫度：≤95℃使其在整個擴增循環中保持足夠活性 pfu DNA 聚合酶 耐熱
5’→3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
度：pfu %26gt;Taq
但pfu擴增效率通常比Taq酶略差 文獻報道：Taq+pfu 會起到較好效果 2、引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，
Tm值要相近，每條10-50pmol /100%26#61549;l
◆設計原則： （1）靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同
3'下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補，與負鏈相同
正鏈5'――――― 3' ――上游Primer
――下游Primer 負鏈 3'――――― 5'
例如：
IL-3正鏈
5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
負鏈3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游~： 與其相同
下游~： 先寫出相應負鏈3'→5'然后倒過來5'→3'
所以負鏈Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3' （2）Primer 本身不要出現內部互補序列
形成loop環，內部二級結構
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意減少Primer間互補序列
導致2個Primer形成dimer
一般不要超過3個互補bp
如：CCCATGC ATGGAGTC
: : : : : : : :
GGGTCTA TCAGTAAGC （4）Primer 5’未端可修飾、突變:
修飾
如：32P、*、熒光素，不影響其效果
突變：AGCTCCATGACCCAG
5'CGCTCCATGACCCAG 3‘
注意：絕不可以在3'端進行上述改造
∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補→不能延伸 （5）primer 5’端增加堿基
①內切酶識別點：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG
↑保護bp
對PCR產物cloning有很大好處
便于內切酶消化，不同內切酶需保護bP數量不同
EcoRI 1 BglII 2-3
XbaI 2-3 HindⅢ %26gt;3
BamHI 2-3 PstI %26gt;4
XhoI %26gt;4 NotI %26gt;10
如果所用保護bp數量不合適→影響內切酶消化→影響下步克隆
∵未切開，連接不上
②ATG起始密碼
③TAA、TAG、TGA終止密碼
如：
可溶性受體的表達，無膜內區、穿膜區，只有膜外區。 3、模板： 可選：DNA
mRNA→逆轉錄→cDNA
DNA包括： 質粒 噬菌體 染色體DNA
較小 較大 ①目的gene是單拷貝
變性較易 變性較難 ②非常大，變性難
模板用量
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng
注意：
防止交叉污染 4、dNTP： 四種脫氧核苷酸，基本原料
終濃度：50%26#61549;M
注意：不穩定，保存時間長會失效 5、Mg2+ TaqDNA聚合酶作用時需要Mg2+
不同的酶需不同Mg2+
Taq：較少，Mg2+ 對反應影響很大，0.5-1.5mM終濃度
pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍
外界影響：
EDTA鰲合Mg2+ ∴選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；
DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基團均可與Mg2+ 結合， 降低Mg2+有效濃度。 ∴如果擴增產物或效率不理想，要注意調整合適的Mg2+濃度 6、溫度和時間： （1）變性溫度：94-95℃
Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑ （2）退火：溫度越高，擴增特異性越好
取決于Tm值：Tm↑退火T↑；
Tm↓退火T↓
若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度 （3）延伸：
%26#61603;500nt---1min %26#61502;500nt--3min
一般：40－60sec （三）PCR技術的應用 1、 基因檢測： 2、基因克隆化 3、DNA突變 4、DNA序列分析 四、基因芯片 （一）利用核酸雜交的原理，應用于DNA、RNA的研究
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用點樣機等機械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點上高密度的、成千上萬個“點”，每個“點”含有可與一種基因雜交的一條ＤＮＡ探針。由于芯片上有序地排列著ＤＮＡ探針，因此也被稱為微陣列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加樣品后，在合適的條件下，樣品中含有的各種核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就與相應的探針雜交。由于核酸片段上已標記有熒光素，激發后產生的熒光強度就與樣品中所含有的相應核酸片段的量成正比，也就代表該基因的表達量。經激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經軟件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達情況。正因為這種特點，基因芯片技術已成為當前生命科學研究的熱點之一。 操作流程 （1）探針的設計、合成與芯片的制作（商品化產品）； （2）靶基因樣品的制備；
靶基因的制備：RT-PCR （設實驗組和對照組）
標記方法：分別進行熒光素標記如：Cy3和Cy5 （3）生化雜交反應；與常規的分子雜交過程基本相似
封閉 預雜交 雜交 洗脫 （4）雜交信號的檢測與結果的分析
激光共聚焦熒光檢測系統收集熒光信號，計算機分析 （二）基因芯片的應用 用于基因轉錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究 舉例：美國斯坦福大學Davis等用PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA。片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細胞和未處理的T細胞種提取的mRNA反轉錄出的單鏈cDNA。片段雜交，經激光共聚焦掃描系統分析，共發現17個差異表達的基因，其中11個是被熱誘導的，6個是被熱抑制的。經序列分析證實，其中3個是未報導的新基因。 上海友騰生物傾力為客戶提供上萬種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產品，質量被全國各大院校科研機構認可。
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