常用設備

準備室的設備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品規（放置消毒過的物品）、包裝臺。

配液室的設備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養室的設備：

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO₂孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。

無菌操作 

無菌室的滅菌：

1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過氧乙酸擦拭。

2.CO₂孵箱（培養箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸，再用紫外燈照射。

3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20～30分鐘。

4.實驗后滅菌：用75%酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

實驗人員的無菌準備：

1.肥皂洗手。

2.穿好*、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋 。

3.用75%酒精棉球擦凈雙手。

無菌操作的演示：

1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、*的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面 。

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過火滅菌。

4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒 

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自來水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%*中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次，zui后蒸餾水沖洗3～5次和用雙蒸水過3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和安全閥，當蒸氣成直線上升時，關閉安全閥，當指針指向15磅時，維持20～30分鐘。

7.高壓消毒后烘干。

二、舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3～5分鐘后，關閉安全閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向15磅時，調節電開關維持20～30分鐘即可。（玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。

金屬器械洗消：

金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序：

1 . 針式濾器帽不能泡酸液，用NaOH泡6～12小時，或者煮沸20分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。 

2. 膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。zui后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。 

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6～12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。zui后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。 

4. 膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養瓶，培養板，凍存管：

6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2～3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000～100000rad的r射線消毒塑料制品效果。 

為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆（CoCI₂•6H₂O）2g，30%鹽酸10m1，蒸餾水88m1。 

注意事項：

1.嚴格執行高壓鍋的操作規程：高壓消毒時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。 

2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。

3.注意人體的防護和器皿的*浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要*，不能留有氣泡，以防止泡酸不*。

細胞培養用液的配制與消毒 

器材與試劑： 

干粉型培養基、*、*、*、純凈水系統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟： 

一. 水的制備：

細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 。

二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄•H₂O 1.56g，KH₂PO₄ 0.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。

三. *溶液的配制與消毒：

*的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對*的作用反應不一樣。*分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，*溶液的作用能力zui強。使用*時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低*的活性，所以配制*溶液時應選用不含Ca²⁺、Mg²⁺的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養液或者*抑制劑終止*對細胞的作用。

1.稱取*：按*液濃度為0.25%，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。 

2.用注射濾器抽濾消毒：配好的*溶液要在超凈臺內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。 

四.青、*溶液的配制于消毒 

1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2.具體操作均在超凈臺內完成。*是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。*是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養液中，使青*的濃度zui終為100單位/ml。1單位＝1微克？

五.RPMI1640的制備與消毒：

1.溶解、調PH值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2～3次（沖洗液一并加入培養基中），充分攪拌至粉劑全部溶解，并按照包裝說明添加一定的藥品。然后用注射器向培養基中加入配制好的青*液各0.5ml，使青*的濃度zui終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾：配制好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。

4.分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。

5.使用前要向100ml培養液中加入1ml*溶液（4℃時兩周有效）。

六.血清的滅活：

細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。

七.HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10～50mmol/L，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。 

1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。

注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20mmol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可*（20ml）加入1L培養液中，或者每100ml培養液中加入2ml即可。

八.*：

合成培養基中都含有較大量的*，其作用非常重要，細胞需要*合成核酸和蛋白質，*缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的*。由于*在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50%，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液。加有*的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的*。 

一般培養液中*的含量為1～4mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L*液貯存，用時加入培養液。配制方法為，*2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml*溶液。

九.肝素溶液的配制。

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中zui終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為*，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為4℃ 。使用時，向100ml培養液中加入1ml（可加入0.9ml）即可。 

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1%Ⅰ型*同*一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比*大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。 

十一.明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）——即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1%的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。 

其他培養用液的配制：

20ug/ml內皮生長因子。

注意事項：

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值zui終為7.2，可在配制時調PH至7.4。 

細胞傳代培養（消化法） 

具體操作：

一. 傳代前準備：

1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和*的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2.用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。

6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

二.*消化：

1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（*液），注意消化液的量以蓋住細胞，*消化溫度是37℃。

2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

3.吸棄消化液加入培養液：棄去*液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

三.吹打分散細胞：

1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6～8分鐘。

4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四.分裝稀釋細胞：

1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2～3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×10⁵/ml。zui后要做好標記。

五.繼續培養：

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO₂培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25%時為一個+，占50%為++，占75%時為+++。 

傳代細胞培養注意事項：

1.嚴格的無菌操。

2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02%乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH₂PO₄ 0.02g，葡萄糖2.00g，0.5%酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養瓶要*清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產品，質量被全國各大院?？蒲袡C構認可。
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