"免疫組化試驗(yàn)課"，從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)許多研究生的確是免疫組化"新手"，他們 
只注重如何做和zui終的結(jié)果，但對(duì)為什么這樣做不太感興趣。這在平時(shí)帶研究生做組化試驗(yàn)也發(fā) 
現(xiàn)他們一旦按照我之前摸索好的抗體濃度和條件后做出很漂亮的染色結(jié)果后，他們就認(rèn)為自己已 
經(jīng)掌握了免疫組化方法了，結(jié)果不求上進(jìn)，更換一種新抗體后或?qū)嶒?yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果后就很難做出 
來了。 
當(dāng)然，免疫組化對(duì)于我來說還不能說什么都知道，其實(shí)肯定有不懂的問題，只不過我做的多了、 
失敗多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的訣竅，拿來與大家進(jìn)行分享。此外，個(gè)人經(jīng) 
驗(yàn)不可能面面俱到，還需要更多有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友加入分享、糾正和補(bǔ)充。讓我們一起來打造美好 
的棗免疫組化精彩專題更新啦！??！ 
免疫組化 
1、方法操作不難，zui大的難處是出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)如何解決？這就需要掌握免疫組化實(shí)驗(yàn)原理， 
每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對(duì)的方法步驟。如抗體孵育條件主要 
是抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者一般是相互成反比的（相對(duì)），其中濃度是zui重要的先決條件， 
溫度決定反應(yīng)的速度、時(shí)間決定反應(yīng)的量。就拿溫度來說，可以有 4 度、室溫、37 度，我推薦 
4 度*，反應(yīng)zui溫和，背景較淺；而 37 度反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；室溫我不太提倡，除非 
你每次都把環(huán)境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。

2、免疫組化zui大的優(yōu)勢(shì)是定位和定性。相比于其他蛋白檢測(cè)方法，免疫組化具有定性靈敏度高、 
定位較直接準(zhǔn)確，是定位檢測(cè)分析方法。尤其對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。

3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析，但必須是 
背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析zui為準(zhǔn)確，這種原則可能也是我們?nèi)粘徃鍟r(shí)判定 
研究結(jié)果的*條件。 
1 
 
 

4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片 
來做；陰性對(duì)照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗來進(jìn)行反應(yīng)，其余步驟均一致。前者是排除方 
法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。

5、免疫組化的應(yīng)用廣泛，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的zui重要方法之一。如今發(fā) SCI 論文時(shí)，明顯感覺僅 
靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分歡迎，可能是怕你學(xué)術(shù)造假吧。 
當(dāng)然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果。

6、免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而 
做出優(yōu)良的染色切片。我在平時(shí)帶教中就發(fā)現(xiàn)許多研究生把我已經(jīng)摸索很成熟的反應(yīng)條件、濃 
度、方法步驟，重復(fù)運(yùn)用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經(jīng)掌握了免疫 
組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯(cuò)了。失敗往往促進(jìn)你去思考試驗(yàn)原理 
和過程，成功有時(shí)也加快你自傲。

7、實(shí)驗(yàn)方法需要?jiǎng)邮?動(dòng)腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天敢在這 
里說這說那，這是因?yàn)槲医?jīng)過了反復(fù)的動(dòng)手+動(dòng)腦，把理論原理運(yùn)用于實(shí)踐，在把實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的 
問題帶到理論知識(shí)中去解決，zui終把理論與實(shí)踐融會(huì)貫通。 
一、概念和常用方法介紹 
1、定義 
用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位 
定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞 
化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。

2、原理 
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與 
標(biāo)記*、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（A 
KP）等的抗*（如鏈霉親和素等）結(jié)合，zui后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化 
學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在 
細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。

3、分類

1）按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、 
鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。 
2 
 
 
2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比， 
間接法的靈敏度提高了許多。

3）按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵 
白素-*-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗*蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等， 
其中 SP 法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性* 
含量高的組織抗原檢測(cè)。

4、目前幾種常用免疫組化方法簡(jiǎn)單介紹

1）免疫熒光方法

是zui早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素， 
以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光 
素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn) 
行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中 
應(yīng)用較廣。

2）免疫酶標(biāo)方法

免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組 
織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光 
鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前zui常用的技 
術(shù)。

本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于 
光、電鏡研究等。

免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其 
特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有 ABC 法、S 
P 三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。

3）免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能 
迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二 
抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi) 
的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高， 
所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深 
紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。

5、被檢測(cè)的物質(zhì)

組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激 
3 
 
 
素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。

6、特點(diǎn)

1）特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化 
從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴 
細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2）敏感性高。在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性 
不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于 ABC 法或 SP 三步法的出現(xiàn)，使抗體 
稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)， 
使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。

3）定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn) 
行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行 
形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。

7、從蛋白水平檢測(cè)角度，免疫組化技術(shù)與 Western  blotting、ELISA 的異同

1）Western  blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來 
檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然 W 
estern  blotting 也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測(cè)其中抗原含量， 
進(jìn)而間接反映它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。

2）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來檢查體液或組織勻漿中 
蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù)相比，定量zui準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測(cè)方法之一。 
實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)介 
一、SP 三步法

1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。

2）0.3%或 3%H2O2 去離子水（無色液體）孵育 10-30 分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。

3）蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 分鐘

4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議 30 分鐘內(nèi) 4 次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷 
卻，再用 3 分鐘×3 次.

5）血清封閉：室溫 15-30 分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。 
4 
 
 

6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育 2~3 小時(shí)或 4℃過夜（復(fù)溫）。PBS 沖洗，3 分鐘 
×5 次。

7）滴加*標(biāo)記的二抗，室溫或 37℃孵育 30 分鐘-1h。

8）PBS 沖洗，3 分鐘×5 次。

9）滴加 SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或 37℃孵育 30 分鐘-1h。

10）PBS 沖洗，3 分鐘×5 次。

11）顯色劑顯色（DAB 等）。

12）自來水充分沖洗。

13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。

14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?/p>

二、即用型二步法

1）脫蠟、水化組織切片。

2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理。

3）0.3%或 3%H2O2 去離子水孵育 5 分鐘-30 分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 或 TBS 沖 
洗。

4）滴加一抗，室溫或 37℃孵育 30~60 分鐘，或 4℃過夜，PBS 或 TBS 浸洗 3 分鐘×5 次。

5）滴加 enhangcer 增強(qiáng)劑，37 度 30min，PBS 或 TBS 浸洗 3 分鐘×5 次。

6）滴加通用型 IgG 抗體-Fab 段-HRP 多聚體，室溫/37℃孵育 30 分鐘-1h，PBS/TBS 沖洗，3 分 
鐘×5 次。

7）應(yīng)用 DAB 溶液顯色。

8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

三、免疫熒光技術(shù)（略） 
關(guān)鍵環(huán)節(jié)剖析（較前有所更新） 
5 
 
1、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1）標(biāo)本固定：固定的目的是①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗 
原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用 4%多聚 
甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用 Bouin's 液或 mDF 液效果較好。

2）脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要*浸蠟、切片 
時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。

3）脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先 6 
0 度 20min，然后立即二甲苯 1-3 分別 10min（這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定 
的），但當(dāng)天制好的切片一般先 60 度 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全 
易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

4）抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基 
的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè) 
率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、*修復(fù)。修復(fù)液也分為若 
干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。我們實(shí)驗(yàn)室一般用微波修復(fù) 
中火 6min*4 次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻 30min 左右（只要你覺得修復(fù)液的溫度達(dá) 
室溫即可）。

5）細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用 Triton  X-100、蛋白酶 
k 等通透液。如 Triton  X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子 
結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi) 
與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（>10um 厚切片）  和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton  X-100 
作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在 PBS 中加入后終濃度是 0.05%即 
可，而前者終濃度是 0.5%-1%。石蠟切片 4um 左右可以不通透，因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)被切開了。

6）滅活內(nèi)源性過氧化物酶和*：在傳統(tǒng)的 ABC 法和 SP 法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到 
內(nèi)源性過氧化物酶和*的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性 POD 一 
般 3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以 10min 左右，而 0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間， 
一般 10~30min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧 
化氫孵育時(shí)間過長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4 度避光保存。不過，現(xiàn)在已有"第二代即用 
型免疫組化試劑盒"避免內(nèi)源性*的干擾，推薦使用。

7）血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封 
閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā) 
生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫 10-30min。 
但也要防止封閉過度

8）一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中zui重要，包括孵育時(shí)間、溫度 
和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果*；孵育時(shí)間：這與 
6 
 
 
溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37 度 1-2h，而 4 度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min。具體條 
件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般 
有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下， 
然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在 4 度*，反應(yīng)溫和，但時(shí)間超過 16~2 
4h。

9）抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般 PBS 即可，但的抗體稀釋液中除 PBS 
成份外，還加了*防腐劑、BSA 穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種 
原因，我一直用國(guó)產(chǎn)的抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié) 
果（提示可能一抗沒有結(jié)合），zui后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新 
抗體稀釋液的 PH 值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色， 
所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 
次，而一抗孵育后的清洗均為 5 次*5min。注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔 
沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；③沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。 
④PBS 的 PH 和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié) 
果背景一片黃（未見特異性染色），建議 PH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01M。（中性及弱鹼性條件（P 
H7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的 
形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）

11）DAB 顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由 DAB 孵育條件決定。DAB 顯色時(shí)間不 
是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗； 
DAB 顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高 
或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背 
景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB 顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如 
超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（一抗 
4 度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

12）復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核 
染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒 
-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ) 
救的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是 
分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要 
快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

13）封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片 
組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近 
端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另 
一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。

2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)

1）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒 
7 
 
 
利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。

2）組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定 5-10min，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保 
存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。

3）血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來 
源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般 10-30min。

4）一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中zui重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種： 
4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果*；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37 度 1-2 
h，而 4 度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min。具體條件還要摸索。

5）二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液， 
若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間 
先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。zui后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能 
后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

6）復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用 DAPI 復(fù)染。

7）封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖，gan，油，等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避 
免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手 
拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面 
在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。

8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延 
長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次，而一抗孵育后的清洗 
均為 5 次*5min。注意（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫 
落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS 的 PH 
和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃 
（未見特異性染色），建議 PH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于 
免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子 
強(qiáng)度則有利于分解）

9）拍照：有條件的話立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光 
和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序； 
應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時(shí)間每次 
以 1~2h 為宜，超過 90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射 3~ 
5min 后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以 
zui多不得超過 2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天 
熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光 
充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘后；標(biāo)本 
染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中 4℃保存，可延緩 
熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如 
果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈 
8 
 
 
的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。

3、免疫組化和免疫熒光結(jié)果分析：見*場(chǎng)試驗(yàn)講座。 
案例一  DAB 染色后切片著色一片黃/背景深 
背景： 
奧運(yùn)會(huì)期間我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京購(gòu)買的試劑買不到，對(duì)我們的許多 
實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的 SP 三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì) 
期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，*批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感覺比 
較合適（Santa  Cruz 公司 1：200），等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn) 
行，我又從福州邁新頂了一個(gè) SP 試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買 
了一小瓶 10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開始，組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難辨別。 
問題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？

1、  抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋 
抗體來控制。這是zui重要的一條。

2、  一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和*在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過 
延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4、  非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加 
濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5、  DAB 孵育時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高；

6、  PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤為重要；

7、  標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。 
我的實(shí)際解決方案： 
以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的，下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過程與大家進(jìn)行分 
享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于 
用 SP 法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以 
9 
 
 
先排除。

2、其次，DAB 孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)？做出來那一次我是孵育 8min，后來也是 8-10min，我單獨(dú)做 
了一次實(shí)驗(yàn)來排除該因素。結(jié)果孵育 2、5min 時(shí)先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合 
常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后，血清封閉的問題？以前我一般孵育 15-30min，所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室 
溫 1h，其它條件同做出來的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進(jìn)的同時(shí)，也對(duì) PBS 清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，甚至*參照試劑盒說 
明書來進(jìn)行操作（我以前一般一抗 4 度過夜且室溫復(fù)溫 45min、二抗 37 度 30min、SP 反應(yīng) 37 
度 30min），以及過氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與*次做出來相比，只有兩個(gè)地方做了改動(dòng)：因血清不夠 
而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用 PBS 替代一抗稀釋液（我以前還回收抗體，自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定 
劑），其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致（包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)）， 
奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。--因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是 PH 值，于是 
我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和 PBS 的 PH 值，結(jié)果是前者偏酸性（<6、0），而后兩者 
均在 7、5 左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的 PH 值出問題了，于是我又用 PBS 替代抗體稀釋液和新試劑盒 
內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒有做出來：背景很深。這真把我搞慘了。難道還 
有什么原因嗎？通過仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了（老 SP 試劑盒結(jié)果很好），問題是二抗 
沒有結(jié)合上去也不對(duì)（因?yàn)閦ui后背景很深，這說明二抗可能也結(jié)合上去了），DAB 孵育時(shí)間現(xiàn) 
在只用 1、5min 也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清， 
其余試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異 
性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧?/p>

結(jié)果分析顯示：抗體稀釋液的 PH 值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳，望 
大家在以后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太引人注意的關(guān)鍵問題。--慘痛的教訓(xùn)，值得引以為 
鑒。

案例二  DAB 染色后切片著色呈陰性結(jié)果 
背景：

其實(shí)免疫組化在 DAB 染色后一般有四種情況：陽性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很 
深、陰陽臉（染色不均勻）。而陰性染色是許多初學(xué)者經(jīng)常遇到的頭疼問題。我身邊有個(gè)研究生 
同學(xué)在我們實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化，聽說步驟不難，跟我后面做了幾次之后，就自己開始做了， 
連續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因?qū)е碌摹?/p>

10 
 
 

問題及其解答：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液，怎么這 
么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果？另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng) 
有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索*濃度。

2、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié) 
合；建議微波修復(fù)用高火 4 次*6min 試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是*的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還 
可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低；

4、血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

5、DAB 孵育時(shí)間過短。

6、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問題。

我的實(shí)際解決方案：

1、首先，排除組織切片內(nèi)的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)zui重要的因素是抗原 
和抗體。（1）抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過 3-6 個(gè)月，可 
能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重（有文獻(xiàn)支持），此時(shí)可以通過重新用石蠟塊切片來進(jìn)一步驗(yàn)證（蠟 
塊需要低溫保存）。（2）石蠟切片在制作過程中可能因醛基對(duì)抗原決定族的封閉，這需要通過 
抗原修復(fù)來充分暴露，從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，提高陽性率，我一般用 6min*4 次中火微波 
抗原修復(fù)，用*緩沖液。（3）組織切片中本身抗原含量的多少？這方面我有教訓(xùn)的，我 
做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞鑒定，用 1：200 一抗效果很好；但我用 1：200 一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì) 
胞檢測(cè)，幾乎呈陰性，后來證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn)，則一抗也要適當(dāng)提高濃度。

2、其次，檢查抗體有無選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件是否不適。（1）一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn) 
陰性結(jié)果，因?yàn)殪`敏度低但特異性好；一抗的 species  reactivity 中無檢測(cè)組織的種屬，這是比 
較常見的錯(cuò)誤；一抗選擇 rat，而二抗是抗 mouse/rabbit 等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。（2）抗體 
孵育時(shí)間過短，容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議 4 度孵育過夜和 37 度復(fù)溫 45min；二抗我 
一般 37 度 30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。（3）抗體濃度過低。這是陰性結(jié)果 
的zui可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高 
濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度（工作液就好辦了，直接 
滴加），重點(diǎn)摸索一抗的zui適濃度。注意：免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng)，這提示不是濃度越 
高，陽性率就越高，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一 
般比較穩(wěn)定，效果較好；而進(jìn)口分裝次之；工作液可能要注意質(zhì)量問題。

3、同時(shí)，DAB 的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng)，在鏡下觀察，有時(shí)可延長(zhǎng)至 30min。但一般 3-10m 
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in ，此時(shí)背景也較淺。否則，說明抗體濃度不合適。

4、zui后，血清封閉時(shí)間也可相應(yīng)縮短。一般 10-30min，但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)整，封閉主要是降低 
切片的總體背景著色。

5、此外，細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已 
經(jīng)把細(xì)胞切開了，但對(duì)于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。

6、以上原因，都是針對(duì)實(shí)際中常見原因來進(jìn)行分析的，前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰 
性結(jié)果，這就需要新手還是要設(shè)置陽性對(duì)照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的 PH 值過低等 
其它原因的干擾。

總之，要想把免疫組化做好，可能每一個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問題了，需要 
通過先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。

案例三  石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果 
背景：

因?qū)嶒?yàn)需要，于 2008 年 07 月 04 日初次做肝臟組織 ZO-1（一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白）免 
疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化非常熟悉，在園子內(nèi)也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一 
直還沒做過（原理知道，但細(xì)節(jié)不太了解）。我先用石蠟切片做了 5 次，結(jié)果一直不理想（表 
現(xiàn)為未見特異性強(qiáng)染色）；近幾日，我又切了冰凍切片，做了 2 次，終于基本成功了。在這個(gè) 
過程中，我對(duì)免疫熒光染色技術(shù)有了全新的認(rèn)識(shí)，而前些天發(fā)出免疫熒光求助貼，回復(fù)的很少， 
所以有必要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的討論），不妥之處敬請(qǐng)指正。有人會(huì)問酶免疫組化做的好好的， 
為何要做免疫熒光？其實(shí)，這也是我以前思考的難題，現(xiàn)在我認(rèn)為可能胞膜蛋白含量不高，用普 
通免疫免疫組化可能做不出來，需要敏感的免疫熒光方法來進(jìn)行蛋白檢測(cè)（我是看許多外文文獻(xiàn) 
都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。） 
問題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色？

1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案：

（  1）游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不 
能被透析除去。二抗配置時(shí)用透析法或?qū)游龇ǚ蛛x熒光素標(biāo)記的二抗和游離的二抗。購(gòu)買高質(zhì)量、 
高純度的熒光素二抗。

（  2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。

（  3）組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如 Forssman 氏 
抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間。

（  4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗 
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體，以致容易混淆。

（  5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于 
正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。

（  6）熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

（  7）一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至*。

（  8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)清洗時(shí)間。

2、陰性染色產(chǎn)生的原因有：

（  1）一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。

（  2）熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項(xiàng)。

（  3）血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

（  4）抗體稀釋液 PH 值不合適，影響抗原抗體反應(yīng)。

（  5）組織切片不平、裂片或脫片很嚴(yán)重，易引起大塊陰性著色。

（  6）組織標(biāo)本不新鮮或已經(jīng)冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達(dá)的部位陰性染 
色或弱著色。

（  7）熒光顯微鏡不會(huì)使用，激發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。 
已有的常見免疫組化難題集錦 
1、石蠟切片和冰凍切片的比較？

（  1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請(qǐng)教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇?nbsp;
蠟切片時(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片； 
但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。 
（  2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一 
步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的 
片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就 
不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。 
（  3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，

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一定要存在-80 度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一 
貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易 
成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。

2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？

（  1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體 
能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是 
同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物， 
稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈 
敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染 
色（可以通過封閉等避免）。 
（  2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western  blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉 
淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。 
（  3）種屬反應(yīng)性的選擇（species  reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差 
異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。 
(4)種屬來源，一般兔來源的多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源 
來選擇相應(yīng)的二抗。 
(5)生產(chǎn)廠家的選擇。如santa  Cruz公司抗體一般 1ml，價(jià)格 2100 元左右；而chemicon公司一抗 
一般 100ul，價(jià)格 2800 元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般 
用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western  blotting效果還可以。

3、在什么情況下使用TritonX-100？

（  1）Triton  X-100 化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um 
厚切片)  和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton  X-100  作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。 
（  2）其作用原理：Triton  X-100  可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大 
分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入 
胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 
（3)Triton  X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用，具體參閱：  http://www.dxy.cn/bbs 
/post/view?bid=68&id=12301317&sty=1

4、封閉血清的選擇原則是什么？

（  1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！ 
（  2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng) 
的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。 
（  3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

5、抗體孵育條件的比較？

（  1）一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果*；孵育時(shí)間：這與溫度、抗 
體濃度有關(guān)，一般 37 度 1-2h，而 4 度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min。 
（  2）二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。 
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6、一抗 4 度孵育后為什么要進(jìn)行 37 度復(fù)溫？

（  1）一方面，防止切片從 4 度直接放入PBS易脫片； 
（  2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 度和 37 
度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高 
了并易造成非特異染色。 
（  3）其實(shí)，我更贊同后一種說法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或*子從 4 度過夜拿出后，直接用PB 
S洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯！

7、DAB顯色時(shí)間如何把握？

（  1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗； 
（  2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度 
過高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間； 
（  3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng) 
封閉時(shí)間； 
（  4）DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過 
低或孵育時(shí)間過短（一抗 4 度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

8、免疫組化結(jié)果如何分析？

（  1）陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在 40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性 
著色細(xì)胞，每組 3~6 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。 
（  2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imag 
e  j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。 
（  3）評(píng)分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（0~3 分為陰性著色、淡黃色、 
淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評(píng)分（1~4 分為 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%）， 
zui終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。 
對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、 
背景很淺的高質(zhì)量切片。

9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？

（  1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作 
用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。 
（  2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、*修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種 
（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。 
（  3）微波修復(fù)，我們一般用 6min*4 次，效果不錯(cuò)。

10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？

（  1）一般 3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以 10min左右；而 0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉 
時(shí)間，一般 10~30min。 
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（  2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時(shí) 
間過長(zhǎng)易引起脫片. 
（  3）現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4 度避光保存。

11、如何才能充分脫蠟？

（  1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽性物時(shí)隱 
時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須*脫蠟，目前用 
于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短； 
（  2）脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟 
試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5 分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較 
陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20 分鐘或更長(zhǎng)。 
（  3）當(dāng)天切的切片，燒烤 2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程， 
如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫 10-20 分鐘，然后再行脫蠟，這 
樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。 
總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹 
底、干凈、*地脫去切片上的蠟。

12、如何zui大限度地降低組織非特異性染色？

（  1）縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。 
（  2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 
（  3）內(nèi)源性過氧化物酶和*在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通 
過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 
（  4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加 
濃度來加強(qiáng)封閉效果； 
（  5）縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等； 
（  6）適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 
（  7）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？

（  1）蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。 
不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木 
素中染色即可。 
（  2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中 
數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。 
（  3）如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。

14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？

（  1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。 
臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)?nbsp;
一個(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響zui后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的 
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PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。 
（  2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。 
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對(duì) 
準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫 
落。 
（  3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。 
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi) 
時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗， 
就能*沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù) 2 分鐘左 
右就*足夠了。 
（  4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。 
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分 
解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。［］免疫組化P56 我們 
目前常用的PBS的PH在 7.4-7.6 濃度是 0.01M，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格 
便宜配制方面，使用效果好。 
（  5）常用試劑的配制和使用。 
在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得zui多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、 
換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩 
沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。

15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？

（  1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子 
了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。 
（  2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法 
不好等。 
（  3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。 
（  4）沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。 
（  5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸 
水。 
（  6）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長(zhǎng)了，或者放進(jìn) 100 度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚 
的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到ED 
TA的時(shí)候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。 
（  7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖。基 
本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

16、背景染色較深的原因有哪些？

（  1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì) 
其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型 
的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色。 
（  2）抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或 
報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高， 
要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的 1 小時(shí)，而是 30 分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 
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（  3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DA 
B不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降 
低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的 
顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色 
機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過 
長(zhǎng)。 
（  4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流 
失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP  Pen在組織 
周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。 
（  5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于 24 小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。 
有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和 
修復(fù)液的容器放在 4ºC冰箱過夜，對(duì)結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出 
現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。 
（  6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著 
色。用新買抗體時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。

17、蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)這一步如何做、濃度多少、時(shí)間多長(zhǎng)? 
答：返藍(lán)可以用堿性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或 45 度溫水、冷水藍(lán)化均可。一般藍(lán)化 5~ 
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