北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

：

喹諾酮類ELISA試劑盒

1 概要

氟喹諾酮類抗生素(QNS)常用于防止大型畜產動物或養殖魚飼養時，由于飼養密度過高所造成的感染癥狀：尤其對于肺臟、泌尿及消化系統的細菌感染，氟喹諾酮類抗生素可達到預防與治療的效果。然而，氟喹諾酮類抗生素對人體常引發副作用包括:胃腸道及頭暈、失眠、頭痛等中樞神經系統反應。

近十年來，由于氟喹諾酮類抗生素用于大型畜產動物或養殖魚飼養明顯增加，及人民對于食品健康日益重視，上紛紛限制氟喹諾酮類抗生素用于大型畜產動物或養殖魚飼養。因此，監測氟喹諾酮類抗生素殘留成為把守大眾健康刻不容緩的議題。

傳統上，一般是以HPLC篩選喹諾酮類抗生素殘留量，再以LC/MS/MS進行zui后確認；然而，此過程花費太多時間與經費。因此，我公司開發出檢測時間少于90分鐘的氟喹諾酮類多合一ELISA試劑盒，本試劑盒操作簡便且省時、經濟、檢測范圍廣(水產類與農畜類樣品皆可適用)，且檢測靈敏度高。

本試劑盒可用于定量、定性檢測生乳、雞肉、魚肉、豬肉和蝦等樣品中氟喹諾酮藥物的殘留。

2 原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA法檢測樣品中的氟喹諾酮。在微孔板上預包被抗氟喹諾酮單克隆抗原，喹諾酮抗體和HRP標記的喹諾酮二抗競爭結合微孔板中氟喹諾酮抗原以及標準品或者樣品中的氟喹諾酮，洗滌后用H2O2-TMB底物系統顯色，樣品吸光度值與其所含喹諾酮量成負相關，與標準曲線比較即可得出氟喹諾酮含量。

3 試劑盒組份

每個試劑盒中的試劑可進行96個測量（包括標準測定），試劑盒組份：                                                                                                                  

包被有氟喹諾酮抗原的酶標板---------------96孔（8孔/條×12條）

氟喹諾酮標準品溶液---------------------------------6瓶（1.5 mL/瓶）

分別為0號：0 μg/L；1號：0.1 μg/L；2號：0.3 μg/L；3號：0.9 μg/L；4號：2.7 μg/L；5號：8.1 μg/L。

10×濃縮洗滌液-------------------------------------------1瓶（40 mL）

5×濃縮樣品復溶液---------------------------------------1瓶（40 mL）

抗體工作液 ---------------------------------------------1瓶（7 mL）

酶標記物----------------------------------------------------1瓶（12 mL）

底物溶液A---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液B---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

終止液--------------------------------------------------------1瓶( 7 mL）

封板膜-------------------------------------------------------------------1張

說明書-------------------------------------------------------------------1份4 另外所需試劑和儀器

4.1 試劑

l 正己烷（分析純）

l 乙腈（分析純）

l 乙酸yi酯（分析純）

l 二氯jia烷（分析純）

l 十二水合磷酸氫二鈉（分析純）

l 二水合磷酸二氫鈉（分析純）

4.2 儀器

l 恒溫培養箱

l 振蕩器

l 均質機

l 天平(精確到0.01 g)

l 可調式 20~200 μL 和 100~1000 μL 微量移液器

l 酶標儀（450 nm）

l 離心機

l 氮吹儀

4.3 溶液的配制

l 樣品復溶液：將5×濃縮樣品復溶液與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:4的比例，混合均勻

l 0.05 M PBS：稱取12.9 g十二水合磷酸氫二鈉和2.18 g二水合磷酸二氫鈉用去離子水（或蒸餾水）混合均勻定容至1 L

l 蜂蜜方法一提取液：量取35 mL乙酸yi酯和70 mL 二氯jia烷充分混合均勻

l 蜂蜜方法二提取液：稱取5 g氯化鈉，3 g十二水合磷酸氫二鈉，0.2 g氯化鉀，0.2 g磷酸二氫鉀用去離子水（或蒸餾水)充分溶解定容至500 mL

喹諾酮類ELISA試劑盒

5 樣品處理

5.1 牛肉、豬肉、雞肉、豬肝、雞肝

l 稱取1 g 均質樣品于50 mL離心管中，加入0.5 mL1×樣品復溶液，充分渦動20 S，再加入4.5 mL乙腈，用振蕩器振蕩渦旋5min直至組織*分散均勻

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 取1 mL上清液于另一干凈10 mL離心管中于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機相以及中間層雜志，取下層液體待分析

l 雞肉、豬肉樣品，直接取50 μL下層液體用于分析，稀釋倍數為5倍

l 牛肉、豬肝、雞肝樣品，取100 μL下層液體和100 μL1×樣品復溶液，充分混合均勻后，取50 μL用于分析，稀釋倍數為10倍

5.2 魚肉、蝦肉（稀釋倍數為10倍）

l 取1 g均質樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL 1×樣品復溶液，充分振蕩渦旋1 min使組織*分散，再加入8 mL乙腈充分振蕩混勻5 min

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 取1 mL上清液于另一干凈10 mL離心管中于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析

5.3 牛奶

純牛奶（稀釋倍數為10倍）

l 取50 μL純牛奶樣品于離心管中，加入450 μL1×樣品復溶液，震蕩混合約1分鐘

l 取50 μL用于分析

生鮮奶（稀釋倍數為1倍）

l 直接取新鮮生鮮奶50 μL用于分析（如果生鮮奶中脂肪含量過多，則室溫下4000 rpm離心10分鐘，去除上層脂肪）

5.4 蜂蜜

方法一：（稀釋倍數為2倍）

l 取1 g均質樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL 0.05 MPBS（見配液）震蕩混合至蜂蜜*溶解，再加入8 mL蜂蜜方法一提取液（見配液）充分震蕩混合5 min

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 棄去上層液體，取下層有機相4 mL于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析

     方法二（稀釋倍數為4倍）

l 取1 g均質樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL蜂蜜方法二提取液（見配液），渦旋震蕩至蜂蜜*溶解

l 加入4 mL乙腈充分振蕩混勻

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析 

6 注意事項

l 使用前請先將喹諾酮標準溶液6瓶、樣品復溶/稀釋液、酶標抗原、底物溶液及微孔條置于室溫下，至少回溫30分鐘。 

l 取出所需微量測試孔條，將剩余未測之孔條立即放回鋁箔袋中，置于2～8 ℃保存。

l 10×濃縮樣品復溶液與10×濃縮洗滌液請用蒸餾水稀釋10倍后使用，即10×濃縮樣品復溶液：蒸餾水= 1：9 稀釋，1×樣品復溶液和1×清洗液可于2～8℃保存一周。

7 操作步驟

l 試劑準備：

1×洗滌液的配制，將10×濃縮洗滌液和蒸餾水（或去離子水）按1: 9充分混勻。

l 編號：將喹諾酮類標準品和待測樣品對應微孔按序編號，建議每個標準品和待測樣品均做重復孔。

l 加樣：每孔加標準品或樣品溶液50 μL，然后每孔分別加入50 μL 氟喹諾酮抗體工作液。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續洗板4~5次，每次間隔10S左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 加酶標記物：每孔加入氟喹諾酮酶標記物100 μL

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續洗板4~5次，每次間隔10S左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 顯色：每孔加入底物溶液A50 μL，再加入底物溶液B50 μL室溫（20～25℃）避光靜置15分鐘。

l 測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，測定450 nm處吸光度值。

北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

：