間接法的原理
標本中的待檢抗體與固相抗原結(jié)合后，利用酶標與抗體（抗人Ig）進行檢測。
測定抗體的簡接ELISA法。病原體或其他外源大分子物質(zhì)進入機體后都可能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以可以通過檢測某種病原體的相應(yīng)抗體來判斷機體是否曾經(jīng)被某種病原體所感染，達到診斷的目的。
間接法是測定抗體zui常用的方法。該方法首先將已知定量的抗原（如某個病原體的蛋白質(zhì)）吸附（也稱包被）與固相載體（微孔滴定板的微孔內(nèi)），加入待檢測的樣品（如病人血清含相應(yīng)抗體為*抗體）與之結(jié)合。溫育反應(yīng)一定時間。此時，如果血清中含有該病原體蛋白質(zhì)的抗體（*抗體）時，則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后，加入酶標抗球蛋白抗體（第二抗體即酶標抗抗體，如血清為人血清，則加入抗人抗體的抗體），該酶標抗抗體就與已知固相抗原結(jié)合的*抗體結(jié)合，形成抗原—抗體—酶標第二抗體的復(fù)合物，同樣保溫、洗滌后加入無色的酶底物，保溫一定時間進行酶促反應(yīng)，酶催化底物顯色，觀察反應(yīng)后顏色的有無及深淺來判斷反應(yīng)結(jié)果。若有顏色反應(yīng)，說明檢測樣品中含有相應(yīng)的抗體，所以是陽性反應(yīng)。根據(jù)顏色深淺，還可以進行定量分析。反之，若無色，說明樣品中無相應(yīng)抗體，為陰性反應(yīng)。
間接法的操作步驟
1、包被固相載體：用已知抗原包被固相載體，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原和雜質(zhì)；
2、封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉，阻止待檢血清中非特異IgG吸附固相；
3、加待檢樣本：經(jīng)過溫育（37℃ 2h），使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合。洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)；
4、加酶標抗抗體或酶標SPA：再次溫育（37℃ 2h），使酶標抗抗體與 固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成固相抗原—待檢抗體—酶標抗抗體（酶標SPA）復(fù)合物；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體；
5、加底物顯色：溫育（37℃ 30min）；
6、終止反應(yīng)判定結(jié)果，目測定性或用酶標儀測光密度進行定量分析。
間接法的方法評價
酶聯(lián)免疫間接法是檢測抗體zui常用的方法，應(yīng)用廣泛，敏感，應(yīng)用一種酶標抗抗體可以用于檢測一個種系內(nèi)各種抗原的相應(yīng)抗體。
間接法的應(yīng)用
間接ELISA法主要用于抗體的檢測。運用此法可以檢測：人類免疫缺陷病毒HIV（-1/2）抗體，丙型肝炎病毒抗體（抗HCV），戊肝抗體（抗HEV），庚肝抗體（抗HGV）等。以檢測丙型肝炎病毒抗體為例，如下：
檢測丙型肝炎病毒的適應(yīng)癥為：用于檢測血清或血漿中丙型肝炎抗體，供獻血員篩選機臨床輔助診斷。其原理為：將HCV結(jié)構(gòu)區(qū)核心蛋白和非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的混合抗原包被于微孔條，樣品加到固相抗原板上，當樣品中含有HCV特異性抗體（*抗體時），則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入過氧化物酶標記的抗人（IgG），則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入過氧化物酶標記的抗人IgG抗體（第二抗體），該酶標抗體就與已和固相抗原結(jié)合的*抗體結(jié)合，形成抗原—抗體—酶標第二抗體的復(fù)合物，再加底物，酶催化底物顯色。在因性反應(yīng)中，因樣品中不含HCV的抗體，酶標抗體不能與之結(jié)合，故無顏色變化。
