試驗(yàn)原理：

ANG-1試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知ANG-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將ANG-1和*標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ANG-1的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）

96孔配置

48孔配置

配制

96/48人份酶標(biāo)板

1塊板（96T）

半塊板（48T）

即用型

塑料膜板蓋

1塊

半塊

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品：8.0ng/ml

1瓶（0.6ml）

1瓶（0.3ml）

按說(shuō)明書進(jìn)行稀稀

空白對(duì)照

1瓶（1.0ml）

1瓶（0.5ml）

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液

1瓶（4.0ml）

1瓶（2.0ml）

即用型

*標(biāo)記的抗TLR-4抗體

1瓶（6.0ml）

1瓶（3.0ml）

即用型

親和鏈酶素-HRP

1瓶（8.0ml）

1瓶（4.0ml）

即用型

洗滌緩沖液

1瓶（20ml）

1瓶（10ml）

按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋

底物A

1瓶（6.0ml）

1瓶（3.0ml）

即用型

底物B

1瓶（6.0ml）

1瓶（3.0ml）

即用型

終止液

1瓶（6.0ml）

1瓶（3.0ml）

即用型

標(biāo)本稀釋液

1瓶（12ml）

1瓶（6.0ml）

即用型

自備材料

蒸餾水。
加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。
實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項(xiàng)

試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

血清-----操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

8.0 ng/ml

（6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

4.0 ng/ml

（5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.0 ng/ml

（4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.0 ng/ml

（3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0.5 ng/ml

（2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0.25 ng/ml

（1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0 ng/ml

（空白對(duì)照）

原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟

使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。
甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）

A

8.0

8.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

B

4.0

4.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

C

2.0

2.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

D

1.0

1.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

E

0.5

0.5

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

F

0.25

0.25

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

G

0

0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

H

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

局限

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析

1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TLR-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的TLR-4含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測(cè)值范圍：0-8.0ng/ml

4、敏感度： 0.01 ng/ml

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