谷研試劑-動(dòng)物組織切片原位雜交的改進(jìn)技術(shù)

一、所需試劑

*（使用時(shí)用3%的檸檬酸稀釋?zhuān)?，原位雜交預(yù)雜交液，封閉液，，*化抗，*化過(guò)氧化酶，松脂油，氯化鈉，十二水合*，二水合*，鏈霉親和素-*復(fù)合物(streptavidin-biotincomplex，SABC）4%多聚甲醛，檸檬酸三鈉，丙三醇，二甲苯，DEPC水，3%過(guò)氧化氫酶溶液。

二、所需器皿

原位雜交蓋玻片，37度或53度恒溫孵育箱，60度烤箱，吹風(fēng)機(jī)，孵育保濕盒等。

三、實(shí)驗(yàn)操作

1、從將動(dòng)物解剖后所獲得的組織一般是經(jīng)過(guò)石蠟包埋制成臨床組織切片，故應(yīng)先去掉包埋在組織表面的石蠟，將切片放至60度烤箱烘烤1h，一小時(shí)后，將切片趁熱放至松脂油內(nèi)，在松脂油內(nèi)放置10min×2次，以溶解切片組織表面的石蠟。

2、切片從松脂油內(nèi)取出后分別在*，90%，70%，50%的酒精內(nèi)各浸泡5min×2次（按照酒精濃度依次降低的順序進(jìn)行漂洗），以洗掉殘留在組織表面的松脂油。

3、不同濃度的酒精浸泡完之后，再將切片放在3%過(guò)氧化氫酶溶液中浸泡10min，DEPC水漂洗5min×3次。

4、用吸水濾紙將切片組織附近的水分吸干，但是注意不能碰著組織以免破壞組織，在組織表面滴加數(shù)滴4%多聚甲醛（以*覆蓋組織為準(zhǔn)），將切片放至孵育保濕盒內(nèi)（盒內(nèi)放入水和丙三醇以體積比1:1的混合液，以保持盒內(nèi)的濕潤(rùn)環(huán)境）在室溫固定15min，DEPC水漂洗5min×3次。

5、吸水濾紙吸干后在組織上滴加原位雜交預(yù)雜交液（亦是以*覆蓋組織為準(zhǔn)），此時(shí)要注意自己所要檢測(cè)的是基因探針還是miRNA探針，基因探針的孵育溫度是37度，RNA探針的孵育溫度是53度，孵育保濕盒內(nèi)孵育4h。

6、孵育完預(yù)雜交液之后即要孵育探針雜交液，條件同預(yù)雜交液一致，孵育保濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜（雜交時(shí)間不能少于16個(gè)小時(shí)）。

7、將切片取出后放在提前預(yù)熱好（預(yù)熱至37度）的2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC溶液內(nèi)各漂洗5min（2×SSC配方：100mL水中將加入氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉8.8g，0.5×SSC及0.2×SSC溶液用2×SSC以相應(yīng)比例稀釋即可）。

8、吸水濾紙吸干SSC溶液，向組織表面滴加原位雜交封閉液，室溫孵育30min。

9、向組織表面滴加溶液（用于標(biāo)記核酸探針），37度孵育箱內(nèi)孵育2h，取出后用1×PBS漂洗5min×4次（原位雜交5×PBS配方：850mL水中加入氯化鈉120g，十二水合*24g，二水合*1.6g）。

10、向組織表面滴加SABC溶液，37度孵育30min，取出后1×PBS漂洗5min×4次。

11、向組織表面滴加*化過(guò)氧化物酶，37度孵育30min，取出后1×PBS漂洗5min×4次。

12、配制DAB顯色液：在850uL水中按順序分別加入A，B，C試劑各50uL。配制好的DAB顯色液要避光保存，且在30min內(nèi)有顯色效果，因此要現(xiàn)用現(xiàn)配。DAB顯色時(shí)間為室溫下2min即可，染色結(jié)果為棕色。DAB染色后用DEPC水清清漂洗5min。

13、蘇木素染核室溫4min，然后用預(yù)熱好的溫水（37度）漂洗5min。

14、依次用70%，90%，*的酒精溶液分別漂洗5min，（注意：此時(shí)用酒精漂洗的目的是使組織脫水，故按酒精濃度照依次升高的順序進(jìn)行漂洗，若脫水不好會(huì)使組織成片渾濁，不利于觀察拍照；而之前為了洗去殘留的松脂油則按照酒精濃度照依次降低的順序進(jìn)行漂洗。）

15、將切片放至通風(fēng)櫥內(nèi)的二甲苯內(nèi)浸泡2min（二甲苯浸泡的目的是出組織表面的有機(jī)雜質(zhì)，使切片變得透明清晰），并在通風(fēng)櫥內(nèi)用吹風(fēng)機(jī)吹干（注意：1、二甲苯有毒，操作時(shí)需帶口罩；2、用吹風(fēng)機(jī)吹干時(shí)，調(diào)解吹風(fēng)機(jī)檔位使風(fēng)的溫度不能太高，以防止將組織灼燒破壞。）

16、在吹干的組織上滴加一小滴中性樹(shù)膠油，將蓋玻片輕輕放在樹(shù)膠油上，以免產(chǎn)生氣泡。

17、在電子顯微鏡下觀察拍照，拍照時(shí)一張切片要同時(shí)在20倍和40倍視野下分別拍照，而且40倍視野要在20倍視野范圍內(nèi)拍攝。

觀察結(jié)束后將切片常溫或4度保存即可。