酶聯免疫試劑盒的洗板方法說明

    在酶聯免疫試劑盒試驗中，洗板是非常重要的過程。酶聯免疫試驗（ELISA）洗滌過程雖不是一個反應過程，但卻也決定著實驗的成敗。
　  ELISA就是通過洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的，通過洗滌以清除殘留在微孔板中未能與固相抗原或抗體相結合的物質，以及在反應過程中的非特異性吸附于固相載體上的干擾物質。聚苯乙烯對蛋白質的吸附是普遍的，在ELISA測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，洗滌時又應將這些非特異性吸附的干擾物質洗滌掉。在ELISA操作中，洗滌是非常關鍵的，應引起操作者的高度重視。　我們對753例用ELISA方法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的洗板過程進行了檢測，采用我們自創的人工洗板法和全自動洗板機洗板對比試驗，現將結果報告如下。
1  材料和方法
1.1  材料
1.1.1  標本來源及類型  753例標本來源于廣東省深圳市龍崗區南嶺人民醫院2005年12月8日至2006年1月4日的工廠體檢血清標本，其中男性121例，女性653例，年齡17歲～43歲,平均年齡為30歲。
1.1.2  *（酶聯免疫法）由上海信然生物技術有限公司生產。
1.1.3  一個大的臉盆和一些棉質毛巾。
1.1.4  消毒劑  健之素（含有效氯500 mg/片）。
1.1.5  特建一個有開關口的洗滌池。
1.1.6  全自動洗板機  美國MultiwashⅡ。

1.2  方法
1.2.1  手工法  按試劑說明書嚴格操作，稀釋液用蒸餾水按1∶20稀釋濃縮洗液，適量置于臉盆之中。從37 ℃水浴溫箱中拿出溫浴到時的反應板，到洗滌池處，放開自來水約1 min，然后快速甩掉反應液，即用自來水沖洗數次，甩掉水并用干凈的毛巾吸干，放入配好洗滌液的臉盆之中，浸泡5 min～10 min，然后將反應板取出，甩掉洗滌液，再用自來水沖洗數次，用干凈吸水的毛巾拍干（多次）反應板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入37 ℃水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標儀讀板，觀察結果。按感染性醫療廢物處理洗滌池的液體及用過的洗滌液：加入健之素（500 mg/片），使其濃度達到2 500 mg/L，浸泡24 h，收集起來，交醫療廢物處理公司處理。
1.2.2  洗板機法  按試劑說明書嚴格操作，稀釋液用蒸餾水按1∶20稀釋濃縮洗液，適量置于洗板機洗液瓶里。將反應到時的反應板取出，用洗板機洗板5次，每次浸泡1 min，取出，用干凈的毛巾拍干（多次）反應板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入37 ℃水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標儀讀板，觀察結果。
1.2.3  假陽性排除  實際工作中，我們發現假陽性一般顯色都較淡，即弱陽性；為了排除假陽性，將753例中18例弱陽性（酶標儀讀數0.1050.05，兩種洗板方法差異無顯著性，結果見表1。
表1  753例HBsAg（手工法和洗板機法洗板）檢測結果（略）
注：組間比較，χ2=0.01，P>0.05。
2.2  18例弱陽性標本的檢測  用兩種方法洗板，結果陽性15例，陰性3例為假陽性；弱陽性率占753例樣本的2.39%（18/753），假陽性占0.39%（3/753）。
2.3  3例弱陽性標本  經重新處理標本，重新檢驗，用兩種方法進行洗板檢測，結果3例都為陰性，而未出現1例陽性，確定3例為假陽性，應排除。
3  討論
根據酶聯免疫試劑盒檢測原理可知洗滌是為了去除未結合的多余的酶標物質，但又不能把結合的酶標物質洗脫，它即簡單又重要，即可用手工法也可用機械法。筆者用ELISA法檢測了753例體檢血清標本的HBsAg，分別用我們自創的手工法洗板和全自動洗板機法洗板，進行組間比較，P>0.05，結果差異無顯著性。也就是說可用手工法代替洗板機法洗板，兩種洗板法得出的結果都可靠，我們認為用手工法洗板更加簡單、，可提高工作效率。筆者對18例弱陽性標本進行了重復檢測，并用手工法和洗板機法兩種方法洗板測定，其中有3例弱陽性標本經重復檢測后為陰性，確定為假陽性，假陽性占753例樣本中的0.39%，假陽性往往顯色都較弱，表現為弱陽性。弱陽性的出現，主要是由于標本沒有處理好造成，伴有溶血或其他因素引起血清渾濁較為常見，而這些樣品在HBsAg的ELISA檢測中常出現假陽性［2］，纖維蛋白、紅細胞、標本溶血是弱陽性發生的主要原因。尤其是纖維蛋白可非特異性地吸附在載體上，并吸附酶標抗體，難于*洗脫，因此，標本要充分凝固，離心要充分，使血清分離良好，吸樣時不要吸到紅細胞。如標本溶血較嚴重，建議重新取樣，因為血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物酶的活性，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度過高，則其很容易在溫育過程中吸附于固相上，從而與隨后加入的HRP底物反應顯色［3］。在假陰性方面，753例檢測中，都做雙孔陽性對照，結果兩種洗板方法都未出現陽性對照陰性結果的現象，可見手工洗板法不會出現假陰性的現象。用手工法洗板經濟、實用，只需一個臉盆，一個特建的洗滌池，成本非常低，并可*使用，其經濟實用不言而喻；而全自動洗板機，價格昂貴，對于基層醫院是個不小的負擔；對于大醫院或繁忙的醫院，則要多臺同時使用，且容易堵塞、出故障，給工作帶來不便，其維護、保養、維修也是一個不小的負擔。在控制感染性醫療廢物方面，只要嚴格要求，將使用后的洗滌液也倒入洗滌池之中，按2 500 mg/L的濃度，加入健之素，浸泡24 h，然后收集，交醫療廢物處理公司處理，則*可以控制感染。沖板用的自來水，只要符合國家自來水供水標準，便可使用，但洗板開始前，應打開自來水開關，讓自來水空流1 min～2 min，以使沉積的臟水流去。遇自來水混濁時，不可使用。綜上所述，在酶聯免疫試劑盒方法檢驗當中，手工法洗板和洗板機洗板，沒有本質上的差別，兩種方法結果都可靠。但手工法簡單、經濟、、實用，值得規范、推廣。