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北京雅安達生物技術有限公司

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進口原裝 北京低* QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) 高品質

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更新時間:2022-08-03 13:42:16瀏覽次數:553次

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進口原裝 北京低* QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) 高品質

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性能

EndoFree Plasmid Buffer Set將高效的內毒素去除步驟整合到質粒純化過程中,不需要額外步驟,也不需使用親和柱去除脂多糖。通過QIAfilter Cartridge過濾細菌裂解液,通過重力流QIAGEN-tip陰離子交換技術純化質粒DNA。

EndoFree Plasmid Kits去除細菌在裂解過程中釋放的內毒素,內毒素會影響原代細胞和敏感培養細胞的DNA轉染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無內毒素DNA高度適用于可重復且結果可靠的轉染(參見Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells")。QIAGEN超純無內毒素DNA也適合基因治療研究和其他敏感應用。

質粒制備中的內毒素水平*
質粒制備方法 內毒素(EU/µg DNA) 平均轉染率
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 *
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌:大腸桿菌DH5α  質粒:pRSVcat.
† 1 ng LPS = 1.8 EU. 
 根據表中的數據計算 Plasmid purification method versus transfection efficiency.
無內毒素DNA配合原代細胞得到高轉染率*
DNA純化方法 細胞轉染百分比
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁細胞轉染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制備。使用Effectene Transfection Reagent進行轉染。該數據是細胞表達GFP的百分率,由轉染48小時后綠色熒光細胞數量確定。轉染效率是每種純化方法制備的超過2個不同的DNA中6–9個復制樣本的平均值。(數據由C. Chew and J. Parente友情提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)
原理

純化的質粒DNA內毒素污染水平取決于所用的純化方法(參見"Endotoxin levels in plasmid preparations")。硅膠技術純化的DNA具有非常高的內毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對低水平內毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內毒素去除步驟,獲得<0.1 EU/µg的質粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設計的過濾裝置,用于代替細菌細胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可*去除SDS沉淀,清除細菌裂解液,相比離心可大量節約時間,減少1小時的質粒純化時間。QIAfilter Cartridges(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)可輕松有效的澄清細菌裂解液。

QIAGEN-tips中*的陰離子交換樹脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)專為核酸純化而開發。它的分離性能使得DNA純度與連續兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當。由重力流驅動并持續運轉的預裝QIAGEN-tips,zui大限度減少手動制備質粒所需的時間。整個QIAGEN質粒純化系統不使用有毒物質,如*,氯仿,溴化乙錠和CsCl,zui大限度地減少對用戶和環境的危害。

內毒素,又稱脂多糖或LPS,是革蘭氏陰性菌細胞膜的組成部分,如大腸桿菌(參見Bacterial cell wall)。內毒素在質粒裂解純化過程中釋放,并顯著地降低對內毒素敏感的細胞株的轉染效率(參見Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency)。此外,內毒素與DNA競爭“自由”轉染試劑,影響轉染實驗。內毒素也誘導巨噬細胞和B細胞等免疫細胞中的非特異性免疫反應,從而導致轉染結果的誤讀。這些反應包括誘導蛋白質和脂類,如IL-1和前列腺素的合成。總體而言,內毒素在轉染實驗中是不可控變量,影響結果的可重復性,使它們難以對比、解讀。在基因治療研究中,內毒素可造成內毒素休克綜合癥和激活補體級聯,干擾研究。

操作流程

在堿性條件下,細菌細胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過濾后的裂解液中。冰浴后,將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上,在適當的低鹽和pH條件下,質粒DNA選擇性結合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質、代謝產物和其他低分子量雜質,超純質粒DNA被高鹽緩沖液洗脫(參見QIAGEN Plasmid Kit procedures)。DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。

應用

使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感的應用,包括:

轉染,包括原代、敏感和懸浮細胞的轉染
基因治療研究 
基因沉默 
顯微注射

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