干細胞培養

近年來，干細胞不止是生命科學和醫學研究的熱點，也常是人們茶余飯后的談資。從*否決干細胞研究法案到黃禹錫造假風波，干細胞研究總是占據報紙的大幅版面。為什么這么熱門？因為干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，有望用來修復那些被疾病和創傷所破壞的各種各樣的細胞和組織，從而為多種慢性疾病的治療帶來了希望，例如帕金森病、老年癡呆癥、糖尿病、心血管疾病，甚至癌癥。

干細胞根據細胞來源的不同，可分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。當受精卵分裂發育成囊胚時，內層細胞團（Inner Cell Mass）的細胞即為胚胎干細胞。胚胎干細胞具有性，可以自我更新并具有分化為體內所有組織的能力。進一步說，胚胎干細胞（ES細胞）是一種高度未分化細胞。它具有發育的性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。成體干細胞是指存在于組織中的未分化細胞，該種細胞能夠自我更新并能夠分化形成組成該類組織的細胞，包括間充質細胞、造血干細胞、神經干細胞等。成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統，具有修復和再生的能力，成體干細胞在其中起著關鍵的作用。然而與胚胎干細胞不同的是，這種干細胞在培養時生存時間有限制并且只能分化成有限的幾種細胞類型。

目前干細胞有幾百種之多，而且它們的培養特性也各異，就重復性而言，干細胞培養領域還面臨著極大的困難。為干細胞提供一個*的培養條件，尤其是保證細胞處于未分化狀態或者在需要的時候使細胞向專一的方向分化，是干細胞研究中zui大的挑戰。

干細胞的培養
zui初的胚胎干細胞培養都少不了小鼠胚胎成纖維（MEF）細胞制備的滋養層。MEF向培養基中分泌一些未知因子，能支持干細胞生長。后來，研究人員發現在培養小鼠ES 細胞時，向培養基中添加白血病抑制因子（LIF）可以代替滋養層細胞而維持ES 細胞的自我更新能力，但LIF并不能維持人類胚胎干細胞（hESC）的未分化狀態（北京雅安達生物技術有限公司）。因此大部分實驗室還在使用細胞滋養層。然而，MEF細胞在體外的增殖能力較差，且隨著傳代次數增加，其支持hESC生長的能力降低，需要不斷地制備原代MEF細胞，昂貴、費時（北京雅安達生物技術有限公司）。而且鼠源性的MEF可能引起動物源性病原體或支原體的污染，因此很多研究組嘗試用各種人源細胞直接作為飼養層。但也不是所有人源細胞都能很好地支持hESC的生長，而且用異體來源的細胞仍存在一定的交叉污染危險?；谶@些原因，研究人員希望能開發出無滋養層、無血清、成分確定的hESC培養體系。

BD生物科學公司、加拿大StemCell公司就和的WiCell研究所建立了戰略合作關系，開發出更優化、無滋養層的人胚胎干細胞培養環境，包括成分確定的無血清培養液和合適的培養基質。

StemCell公司優化了WiCell 研究所的mTeSR 1培養液配方，并將其商品化。mTeSR 1培養液是一種*、成分確定的無血清培養液。在BD公司Matrigel 基質上，mTeSR 1可用于未分化狀態hESC的維持和擴增，而不必添加其他生長因子。在mTeSR 1中未分化的hESC保持多能標記如Oct-3/4和SSEA-3的高表達。在畸胎瘤測定中，hES可分化成三種胚層的能力也證明了其多能性。

hESC理想的培養環境包括無血清及成分確定的培養液和一個適合hESC生長的培養表面。BD的Matrigel 基質大家應該都聽說過吧，是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜，主要成分是層粘蛋白、IV型膠原和蛋白糖苷肝素硫酸鹽，還包含了生長因子、基質金屬蛋白酶等。BD公司在此基礎上開發了一種更適合hESC生長的優化表面——Matrigel hESC-qualified Matrix，能與StemCell公司的mTeSR 1相匹配，為hESC研究提供了必需的重復性和一致性。mTeSR 1和BD Matrigel™ 基質的結合使用可培養各種WiCell hESC多至20代。

Invitrogen也推出了StemPro hESC SFM——一種*確定的無血清培養基，用于培養人胚胎干細胞。它已經證明能在一系列hESC中維持細胞的多能性。Geltrex matrix則是與StemPro hESC SFM配套使用的基質（北京雅安達生物技術有限公司）。它的主要成分與Matrigel類似，但簡化了生長因子，使批次間穩定性提高，并模擬了體內的環境，為細胞培養提供了一種3D腳手架，使細胞真正感到賓至如歸。另外，Invitrogen還推出了*用于人類胚胎干細胞培養的*確定的基質——CELLstart。它不含細胞來源成分，可以支持hESC貼壁和擴增，并維持多能性和分化能力。CELLstart也能用于間充質干細胞和神經干細胞。

Invitrogen公司還推出STEMPRO MSC SFM，專門用于間充質干細胞（MSC）或來源于骨髓的干細胞的培養。它是*限定的，意味著培養基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這種培養基能使MSC維持未分化狀態超過9代，而用傳統的加血清培養基培養的細胞在5代后就開始出現分化。

但也不是所有的干細胞都喜歡無血清培養基，有些在無血清培養基中生長緩慢，狀態不佳。這時，你也可以有別的選擇，譬如血清替代物或特別的血清。Thermo Scientific HyClone就提供了AdvanceSTEM Serum Replacement和ES-Qualified FBS，適合于支持胚胎干細胞的生長。除此之外，賽默飛世爾科技還與CET達成協議為研究人員提供多種人源成體干細胞、生長培養基和分化培養基（北京雅安達生物技術有限公司）。對所有的CET干細胞都確認了已知的基質細胞，干細胞和造血細胞標記。并且每一個系統都用流式細胞儀進行了分析并且確保純度>95%。所有的干細胞都經過測試并且保證HIV-1, HIV-2, B型肝炎和C型肝炎均為陰性。所有的CET干細胞在銷售之前僅在不含有任何額外生長因子的培養基和血清中生長，這樣可以使分化的可能性降低。它還與Primogenix公司達成協議，為研究者提供小鼠胚胎干細胞：129/X1和B6N。

這些都是賽默飛世爾干細胞計劃（Stem Cell Excellence Program）的一部分。這個干細胞產品線除了Thermo Scientific HyClone AdvanceSTEM試劑、試劑盒和干細胞系外，還包括Dharmacon*的RNAi技術；Nalgene和Nunc的高品質塑料制品；Sorvall, Heraeus, Forma和Revco久經考驗的實驗室儀器；Barnstead的純水；以及Nautilus LIMS軟件和Matrix自動移液操作產品。這些產品將用于干細胞研究的多個方面，包括干細胞收集和制備、擴增和分化、鑒定和分析、以及儲存和運輸。

R&D公司也推出了神經干細胞的擴增試劑盒，用于神經干細胞在無血清培養基中的體外擴增。每個試劑盒中除了N2添加劑外，還包含了促進神經前體細胞增殖的生長因子，如bFGF、EGF等。另外，R&D還有造血干細胞的生長因子組，包含促進HSC體外擴增的多個生長因子——Flt-3 Ligand, SCF, 和Tpo。

干細胞的分化
干細胞研究人員面臨的另一重大挑戰就是使細胞正確分化，也就是分化成你想要的細胞類型。賽默飛世爾科技就有一系列AdvanceSTEM 分化試劑盒，能將間充質干細胞快速分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞。不久前，它還推出了AdvanceSTEM神經分化試劑盒，專門用于支持間充質干細胞分化成神經細胞。分化后的神經細胞可用于研究多種包括帕金森病在內的神經退行性疾病。該試劑盒包括包含有特異生長因子的細胞培養基以及生長添加劑，該生長因子能夠促使干細胞分化。在加入到需要分化的干細胞之前僅需要將培養基及添加劑混合即可。Invitrogen也推出了STEMPRO Adipogenesis和 STEMPRO Osteogenesis分化試劑盒。這些試劑盒包含了培養基和特殊的添加劑，能誘導MSC分化形成脂肪細胞或骨細胞，讓研究者去研究MSC如何分化成多種組織類型。

還有許多工具讓研究人員來檢測分化。一向以抗體見長的R&D就有多種檢測干細胞分化的抗體。Invitrogen還有一個名為BG01V/hOG的細胞系，用GFP報告基因來監測分化。在細胞處于多潛能狀態時，啟動子Oct4具有活性，細胞就會表達GFP。這樣研究者可以很容易觀察到細胞的分化，而不用做基因或蛋白表達分析。

分化也可以通過追蹤與細胞狀態相關的標記來檢測。人類胚胎干細胞在分化和未分化的狀態，表現出*的早期分化標記。Invitrogen的STEMPRO® EZChek Human Tri-Lineage Multiplex PCR Kit可以檢測hESC的早期分化標記（Oct4, AFP, ACTC1, and Sox1）。這個試劑盒可在一個PCR反應中快速檢測細胞的分化狀態和分化成三胚層細胞的可能性。

干細胞研究的*目標是臨床上的細胞移植治療。要達到這樣的高度，干細胞的培養必須滿足穩定、標準化、無污染、長期培養后染色體保持穩定狀態這些先決條件。雖然目前還無法達到這些條件，但各研究機構和廠商都在這個領域都投入了大量的研究精力，相信在不久的將來，干細胞培養系統將會為臨床應用鋪平道路。