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上海哈靈生物科技有限公司
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公司信息
ELISA植物提取試劑盒
2015-7-27 閱讀(729)
本植物RNA提取試劑盒，其原理*不同于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了后者不能區分RNA （本質上是多糖）和其他植物多糖的缺點，能將RNA和其他植物多糖分開，同時還能有效去除多酚和其他植物次級代謝成份。其有效性在近五十多種各類植物（見附錄，包括十分棘手的松柏類植物）中得到驗證。
1. 適用于絕大多數植物，從五十多種植物材料中都成功提取到了總RNA，其中包括松針、柏樹、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物組織，如果實， RNase含量*, 需要另外加RVC抑制其活性）。
2. 操作簡單快速，zui短可以只需要約十五分鐘，可以全在室溫下進行。
3. 得到的RNA平均 OD260/280在1.9左右，可直接用于RT-PCR和Northern等研究。
成份
50 次（3080-50）
250 次（3080-250）
溶液A
50 mL
250 mL
溶液B
15 mL
75 mL
溶液C
25 mL
125 mL
溶液D
25 mL
125 mL
使用手冊
1份
1份
常溫運輸，4℃保存，有效期一年。
氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。
1. 準備
a） 估算試劑和組織細胞的用量并準備足夠的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液（如RNASAVER、無RNase的水或有滅活殘留RNase活性的液相RNase清除劑）。每次微量提取一般需要100-200 mg植物葉片、或50-100 mg植物種子、或200-500 mg植物果實。
b） 溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能會產生沉淀，使用前必須放在65℃水浴使沉淀*溶解。
2、 勻漿
a） 先將新鮮植物組織剪切成小塊（保存在RNALOCKER中的植物組織需用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊），放入10-15 mL塑料離心管中，加入1 mL溶液A，然后用勻漿器勻漿5-20秒，將不超過1 mL的勻漿液轉移至干凈的1.5 mL塑料離心管中（可以不必轉移非液體的細胞碎片）。勻漿時會產生泡沫，但不影響提取效果。有的植物組織（果實）含有大量水份，勻漿液會多于1 mL，轉移時也只取1 mL。
b） 如果用硯磨法破碎植物組織，需將植物組織浸泡在1 mL溶液A中再硯磨，盡量避免植物組織跟空氣直接接觸，然后將硯磨物轉移到新的1.5 mL離心管中。
3、 *次分相
a） 在裝有裂解物的離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。
b） 室溫12000-15000 g離心5分鐘，兩相間將有約5-10毫米厚的細胞破碎物。
c） 將上清液（約0.8 mL）轉移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質和其他雜質，避免觸及或吸取。留下100 μL上清液不取。
4、 第二次分相
a） 在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。
b） 室溫12000-15000 g離心3分鐘，兩相間將有白色膜狀物（蛋白質）形成。
c） 將上清液（約1 mL）轉移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中,避免觸及或吸取有機相及其上面的白色膜狀物。
5、 沉淀
a） 在上清液中加入0.5倍體積的溶液D，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈白色渾濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。如果提取 50 mg以下的微量植物組織樣品，在此步加入天恩澤的微量助沉劑RNADOWN。
b） 室溫12000-15000 g離心3-5分鐘，RNA將在管底形成白色沉淀（約黃豆大小）。如果組織樣品量少或需要提高RNA回收率，也可以延長離心時間到20-30分鐘。
c） 小心移棄上清液，避免觸及管底RNA沉淀。
注意：如果加入溶液D離心后沉淀漂浮在上面，說明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物樣品，也可以適當加無RNase的水稀釋直到沉淀能夠沉下去為止。如果離心后管底有類似氯仿的相出現，說明上一步離心時間不夠或取上清時取到了下層的有機相，可以適當延長離心時間或取上清時留下約100 μL不取或在第四步時加0.3 mL的自備氯仿。
6、 *次清洗
a） 在離心管中加入1mL 75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。
b） 室溫12000-15000 g離心1分鐘，RNA將在管底形成細小沉淀（約芝麻大小）。
c） 小心吸棄上清液,注意不要吸棄RNA沉淀。
7、 第二次清洗
a） 重復第六步一次。
b） 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液,注意不要吸棄沉淀。此步將有效去除殘留的乙醇，否則后續反應會受到影響。
8、 溶解
a） 加入適量（一般為20-100 μL） RNA溶解液使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千萬不要用真空離心法使RNA沉淀過于干燥,否則RNA將變得十分難溶。
9、 檢測
a） RNA完整性的電泳檢測
如果需要做Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡單檢測，可以使用TAE或天恩澤的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒經過去RNase處理，所以不要使用。
尤其需要注意的是不要使用TBE進行RNA電泳，因為TBE所含硼酸是研究多糖的經典方法----硼酸絡合法中的關鍵成分，硼酸通過與RNA核糖中的羥基發生絡合反應，形成RNA分子內或RNA分子間的絡合復合物，使同樣長度的RNA具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA絡合復合物遲留在加樣孔中（一般會誤以為是基因組DNA污染）。RNA分子內或RNA分子間的絡合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數量比例有關，而RNA樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會參與此反應，使硼酸對RNA電泳的影響更復雜，所以TBE對RNA電泳的影響沒有規律性和重復性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。
由于動物細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S （約4800 nt），18S （約1900 nt）和5.8S （約120 nt）三種組成，所以變性膠電泳后應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長度與結合EB的數量成正比（當然還與RNA的二級結構有關，雙鏈部分結合能力比單鏈部分強），所以28S rRNA條帶的熒光強度一般比18S rRNA條帶的熒光強度強1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因為大的RNA被酶降解的可能更大）。
跟動物一樣，植物果實和種子的RNA一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA有四條或更多rRNA帶，多余的RNA來源于葉片中大量存在的葉綠體。
b） RNA產量產率測定
將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH7.5-8.2之間）檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進而計算出RNA的產量（濃度X體積）和產率（RNA產量/組織用量）。
注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測得的低10%-15%，因為核酸光吸收跟溶液pH相關，而DEPC水中的DEPC高壓分解后產生的CO2 與水反應生成碳酸，使溶液pH降低進而降低RNA的光吸收。RNA的產率還隨組織的營養狀態和組織的種類不同而不同，100 mg種子的RNA產量一般為100-120 μg，100 mg葉片為30-60 μg, 100 mg果實為20-40 μg。
c） RNA純度測定
無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間（具體數值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關），OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR等反應。蛋白質污染可以通過酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用天恩澤的DNA Erasol 和PS Erasol去除。
植物RNA提取影響因素
因素
說明
對策
多酚
多存在于植物果實和針葉植物中。勻漿時釋放出來，氧化成醌（多為褐色）后能與RNA共價結合，使RNA在提取過程中進入酚相而丟失。
還原法；螯合法；硼砂法；沉淀法；丙酮法；低pH法。
多糖
廣泛存在于何種組織。其多羥基特點與RNA相似。能去除的多糖會裹走部分RNA而降低其產量；不能去除的多糖與RNA共沉淀，使溶液粘稠，同時還會抑制后續的RT等酶反應。
高鹽沉淀法；低醇沉淀法；CsCl梯度離心法等
蛋白質
包括植物*的RNase和多酚氧化酶。
Proteinase K降解法；抑制劑法；高氯酸鈉沉淀法；變性滅活法。
次級代謝物
多存在于高等植物成熟組織中，成分復雜，水溶。能與RNA共沉淀，抑制后續的酶反應。
CsCl梯度離心法
來源于植物組織RNA提取難點及對策（生物技術通訊，1999。李宏等）。
Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA嗎？
A：不是。用TAE或TBE電泳液和非變性膠電泳RNA時容易產生此現象，天恩澤初步研究發現大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA通過堿基互補或通過硼酸絡合（如果使用TBE作電泳液的話）形成的復合物，加RNase處理后，這些紅色熒光物一般會消失。為避免此現象，建議使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA變性。使用天恩澤優化的上樣/變性/染色三用溶液RNAON可以使RNA在非變性膠上電泳時也有較好分辨率。使用非變性膠時，可以使用TAE或超快電泳液SuperBuffer-2,不要使用TBE緩沖液，因為TBE中的硼酸能與RNA的多羥基形成復合物，RNA很難形成銳利的條帶。
Q：如何確認和去處除污染的基因組DNA？
A：如果懷疑有DNA污染，可以用RNase處理RNA樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA污染。進一步確認可以使用PCR擴增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除劑DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有殘留的RNase污染，所以必須嚴格按照廠家提供的使用手冊進行操作。
A：可能原因：1、電泳沒有使用MOPS緩沖液+甲醛變性膠；2、沒有使用RNA的上樣液或使用的RNA的上樣液放置時間過長；3、植物組織樣品中RNase很多，可以使用RVC（部分植物果實需要此處理）；4、植物組織中含多酚等影響提取的物質（如松柏等植物），可以在溶液A中加入終濃度為0.1 M的硼氫化鈉。
