鑒定導致癌癥轉化的分子事件，對于通過發展靶向藥物來提高肺癌的臨床治療效果非常重要。在過去的十年中，很多研究已經報道了關于非小細胞肺癌（NSCLCs）基因組上的驅動突變。然而，仍然不清楚超過40% NSCLCs的分子致病機理。為了鑒定NSCLCs的新分子靶標，我們對一個33歲肺腺癌病人（該病人不吸煙而且沒有家族癌癥史）的癌癥組織和正常組織分別進行全基因組和轉錄組高通量測序。在該癌癥樣本中并未發現EGFR、KRAS或EML4-ALK融合基因等已知驅動突變。這里，我們報道了在KIF5B和RET原癌基因之間通過10p11.22–q11.21臂間倒位產生的新融合基因。此融合基因過度表達了嵌合的RET受體*激酶，它能自發導致細胞轉化。在20個原發肺腺癌的驗證研究中，我們在2個肺腺癌中鑒定到了KIF5B-RET融合基因。我們的數據表明，一部分NSCLCs是由KIF5B-RET融合基因導致的。嵌合的致癌基因可作為一種很有前景的分子靶標，用于肺癌的個性化診斷和治療。
1、 研究背景
肺癌是死亡率zui高的癌癥之一，世界上每年有138萬人死于肺癌。肺癌晚期病人的平均存活期自診斷時計算不足1年。在西方國家，吸煙是引起肺癌的主要風險因素，其中85%~90%的肺癌與吸煙有關。然而，世界范圍內25%的肺癌患者是從不吸煙的。很多亞洲國家的數據顯示，從不吸煙者占非小細胞肺癌（NSCLC）的30%~40%。肺癌中80%為NSCLC，主要組織類型是腺癌（>50%）。
過去幾年中，在NSCLC中已經發現了一些體細胞突變，如EGFR，KRAS，EML4-ALK。但大部分肺癌患者的基因組中并沒有發現這些突變。超過40%的NSCLC是由未知的遺傳變異造成的。
2、研究策略
樣本：
33歲男性，自祖父母開始沒有家族史，從不吸煙，之前一直很健康。在肺葉右上方有未明顯分化的腺癌，在PET研究中發現已轉移到肝臟和多處骨骼，在病理診斷時，通過CT和超聲引導分別對原發肺癌組織和肝轉移組織進行活檢，在已知突變EGFR,KRAS,EML-ALK的檢測中呈陰性。其中，樣本來自首爾國立大學基因組醫學研究所（見圖1）。
癌組織為石蠟包埋的原發肺腺癌組織，骨骼轉移組織和冷凍的肝轉移活檢組織，對照為同一病人的外周血。進行已知基因排查時，用PCR和Sanger測序檢測原發肺腺癌組織中的EGFR和KRAS突變，用FISH檢測EML4-ALK突變，結果全呈陰性。
圖1. 通過CT引導在原發肺癌組織進行活檢后，伊紅染色的石蠟切片
實驗方法：
從原發肺癌組織，骨骼轉移組織，肝轉移組織和血中提取DNA，從冰凍肝轉移組織提取RNA，從total RNA中合成cDNA。根據Illumina的標準protocol建庫，用HiSeq2000和Genome Analyzer IIX測序。通過對肝轉移組織和血分別進行47.77X和28.27X全基因組測序。骨轉移樣品和原發癌樣品都是石蠟包埋，提取出的DNA質量不足以高通量測序建庫，只能用于驗證。因此本研究主要基于肝轉移和血之間序列的比較（見表1）。
表1. 肺癌病人AK55測序分析的統計總結
為了進行重復驗證，先選擇5個EGFR,KRAS和EML4-ALK檢測呈陰性的冰凍原發肺腺癌組織，用HiSeq2000進行轉錄組測序。另外，再選擇15個冰凍原發肺腺癌組織，通過PCR和Sanger測序檢測EGFR和EML4-ALK呈陰性，KRAS狀態未知。
在全基因組測序的數據分析中，用GSNAP將短reads比對到參考人類基因組（Build36.3,hg18），找出SNV, short indel和large deletion。在轉錄組測序的數據分析中，用GSNAP將短reads比對到一些構建好的mRNA序列而不是參考人類基因組，以避免mRNA剪接導致的比對錯誤。通過PCR和Sanger測序，對KIF5B-RET融合基因進行驗證。
3、研究結果
在肝組織里發現了10,390非同義SNVs，334 CDS indels，70 CDS large deletions。與血對比后剩下8非同義SNVs 和2 indels。SIFT注釋后，發現8個非同義SNVs 的功能不足以導致癌癥，被過濾。
對肝轉移組織進行轉錄組測序（15.16G），并與全基因組測序比較（見圖2），發現了52個融合基因和10個RNA 編輯。但10個RNA編輯的功能影響不足以成為driver mutation，被過濾。
圖2. 肝轉移肺癌組織的全基因組和轉錄組測序數據
52個融合基因中，49個是相鄰基因間（<135kb）的染色體內融合，這可能在癌癥發生中不起作用。有1個是染色體間融合，是由在肝臟中高度表達的haptoglobin （HP） 產生。但此基因功能被認為對細胞轉換沒有影響。剩下的KIF5B-RET和KIAA1462-KIF5B融合基因是較遠基因間（>2MB）的染色體內融合。不過KIAA1462-KIF5B表達水平很低，且KIAA1462為分子功能未知的假設蛋白。只有KIF5B-RET可以在肝轉移肺癌組織的全基因組序列中找到對應的染色體重排，并且在血的全基因組序列中沒有找到對應的染色體重排。此融合基因之前未在人類癌癥中發現（見圖3、4）。
圖3. KIF5B-RET融合激酶的功能結構域
圖4. KIF5B-RET融合激酶的三維結構
通過轉錄組測序數據進一步確認了此融合基因的特征。此融合轉錄本高度表達，表現為34個discordrdant PE reads和60個跨過外顯子接合點的spanning reads（見圖5）。
圖5. 通過跨過外顯子交界處的測序結果檢測出KIF5B-RET融合基因
在技術性驗證中，通過PCR和Sanger測序在肝轉移肺癌組織的cDNA中也驗證到此融合轉錄本。而且有較多reads（8 reads）支持，可以確定存在于肝轉移肺癌組織的主要亞群中（見圖6、7）。
圖6. 通過跨過外顯子交界處的測序結果
圖7. 通過Sanger測序在cDNA驗證融合基因斷裂點檢測出KIF5B-RET融合基因
KIF5B和RET彼此相距10.6Mb，分別位于10p11.22和10q11.2，在兩條不同的鏈上，通過染色體反轉形成融合基因（見圖8）。
圖8. 10號染色體發現的10.6 Mb反轉
通過PCR和Sanger測序，在肺癌患者的原發癌組織、骨骼和肝臟轉移肺癌組織的DNA中驗證到染色體反轉，從而確定此融合基因不僅存在原發肺癌組織，還存在于骨骼和肝臟轉移肺癌組織中（見圖9）。
圖9. 通過反轉特異性PCR和電泳檢測KIF5B-RET融合基因
通過Sanger測序鑒定到染色體反轉的斷裂點。斷裂點 （chr10: 42,931,604, hg18）下游2bp處鑒定1bp的刪除，這表明錯誤DNA修復機制可能在雙鏈DNA斷裂后促成了反轉（見圖10）。
圖10. Sanger測序鑒定染色體反轉的斷裂點
為了確定KIF5B-RET是否存在于其他原發肺腺癌組織中，選擇5個沒有EGFR,KRAS,EML4-ALK突變的原發肺腺癌組織進行轉錄組測序，在其中一個（LC_S2）發現也存在KIF5B-RET融合基因。用cDNA PCR進行技術驗證時，也在LC_S2中驗證到此融合轉錄本（見圖11）。
圖11. 針對KIF5B-RET 融合轉錄本進行cDNA PCR和凝膠電泳
另外，還挑選15個原發肺腺癌組織用cDNA PCR進行驗證，它們沒有EFGR和EML4-ALK突變，KRAS突變情況未知。其中一個（LC_S6）顯示有KIF5B-RET融合基因。以上驗證結果顯示，KIF5B-RET融合基因不是稀有的，也存在于原發肺腺癌中（見圖12）。
圖12. 針對KIF5B-RET 融合轉錄本進行cDNA PCR和凝膠電泳
通過Sanger測序鑒定出3個樣本中KIF5B-RET融合基因的斷裂點。外顯子的銜接方式各不相同（見圖13）。
圖13. AK55、LC_S2和LC_S6的KIF5B-RET融合轉錄本比較（藍色代表KIF5B 的外顯子，紅色代表RET的外顯子）
4、討論
• 樣本的正確設置是成功的前提，此樣本具有典型特征：不吸煙者、年輕、多處轉移、無家族史、無已知突變。
• 在不遠的未來，全基因組和轉錄組測序是進行癌癥診斷一項非常重要的程序，尤其對于那些癌組織中不存在已知癌癥driver突變的患者。全基因組和轉錄組測序聯合研究具有重要優勢：首先，DNA和RNA測序數據之間的互相檢驗可以去除很多假陽性。人類基因組大約3G，即使全基因組測序的準確性達到99.9999%，一般也會產生數千個假陽性。第二，轉錄組測序能讓我們只關注與活躍轉錄基因相關的特定基因組變異。癌癥基因組包括數百個體細胞passenger突變，要從中分離出driver突變，需要表達水平的信息。第三，這樣可以發現基因轉錄過程產生變異，如RNA編輯。zui后，轉錄組測序比全基因組測序更容易提供由染色體反轉或移位產生的融合基因的信息。
• 總結下支持KIF5B-RET融合基因具有致癌作用的證據。（1）通過分析發現的此融合基因，是基于不含任何已知driver突變的肺癌；（2）RET在其他癌癥患者也是致癌基因；（3）RET的tyrosine激酶結構域只在含有此融合基因的肺癌樣本中高度表達；（4）伴侶基因（KIF5B）有coiled-coil結構域，是激活致癌融合基因所必需的。
• 我們除了在一個肝轉移肺腺癌組織中發現了1個KIF5B-RET融合基因，還在20個原發肺腺癌中發現了2個，因此我們估計此融合基因在肺腺癌中的頻率為6%。不過此研究的樣本量太小，還需流行病學研究來更準確地了解KIF5B-RET融合基因的頻率?？傊?，這次發現的新KIF5B-RET融合基因可能作為治療肺癌的一個好的分子靶標。
參考文獻
A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Research, 2011.
