如今，單細胞基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學技術，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細胞信號。《Genome Technology》雜志請來了一些專家，來分享他們在單細胞qPCR分析上的經驗。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點啟發。
Q5：您如何定量單細胞qPCR結果？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
單細胞表達譜數據的分析包括三個步驟：normalization、scaling和clustering。用參考基因的表達來均一化（normalization）不適用于單細胞，因為基因表達存在大的、不相關的變化。我們在原先的文章中展示了這一點，自那以后，幾乎所有的基因和細胞都證明了這一點，除了mRNA代謝不活躍的細胞（如卵母細胞）外。更好的做法是均一化每個細胞的表達，也就是直接比較測得的量。這是zui直觀的。當然，這種方法不能說明樣品處理過程中的損失，但我們發現那通常可忽略不計。如果您擔心樣品處理，那么上面提到的RNA加標可用于測定產量和重復性。
對于表達譜分析，數據可以多種方法進行分析。數據可能是unscaled、mean-centered或autoscaled。Mean centering（減去平均值）和autoscaling（減去平均值并除以標準偏差）可平衡分析中標志物的權重。對于單細胞，我們有時候也覺得Mean centering和autoscaling很有用。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學）
如果避免了預擴增，數據可轉換成的cDNA數量，否則數據分析可以Cq值來開展，因為每個細胞的轉錄本水平呈對數正態分布。一開始，可以各種方法對數據作圖，此外，基本的統計分析也應開展（如陽性細胞的數量、平均值和偏差）。細胞數量測定通常是以驗證過的參考基因來均一化的。這種策略在單細胞分析中應避免，因為單個細胞中的所有轉錄本水平隨時間變化。我們發現，校正分析和無監督算法（如Kohonen self-organizing maps）對定義亞群和基因網絡很有用。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫學院）
我們在利用單細胞qPCR進行定量測定時很小心。我們通常只進行定性分析。如果我們定量，我們會利用目的基因的拷貝數相對參考基因的拷貝數。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現在天津大學）
對于每個單細胞，我們對目的基因和參考基因進行qPCR分析，如原核生物的16s rRNA和真核生物的28s或actin。不過，我們也注意到，這些常用參考基因的表達水平在單細胞中也差別很大，對大量細胞qPCR的標準定量法則也須特別謹慎。在大部分情況下，我們報告原始和均一化的Ct值，并使用它們進行單細胞qPCR結果的定量。
Q6：您分析時使用哪些生物信息學工具？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們采用GenEx進行單細胞分析。事實上，我們在所有qPCR數據分析中使用GenEx。GenEx強大、用戶友好，且支持所有的qPCR儀器，這讓從實驗中導入數據和注釋很簡單。GenEx有著的數據質量評估，對單細胞研究很重要，以及強大的單細胞表達譜工具。它有著用戶友好的界面，即使是沒有經驗的用戶也能使用那些強大的工具。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學）
我使用GenEx和SPSS開展數據分析。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現在天津大學）
對于幾十個基因的分析，我們采用ANOVA student t-test或其他簡單的統計學工具。不過，如果以擴增的單細胞cDNA作為模板，分析幾千個基因，則可能需要更*的生物信息學工具。
