如今，單細胞基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學技術，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細胞信號。《Genome Technology》雜志請來了一些專家，來分享他們在單細胞qPCR分析上的經驗。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點啟發(fā)。Q3：在改善單細胞qPCR實驗設計上，您有哪些建議？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
每個細胞可以測定的標志物數(shù)量是有限的，這就讓標志物的選擇很關鍵。選擇標志物的策略取決于研究目的。如果目標是研究表達通路和基因網絡，那么選擇標準就與目標是區(qū)分細胞類型時*不同。一旦標準確定，可利用軟件（如GenEx）中的統(tǒng)計學選擇工具。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學）
單細胞基因表達譜分析通常需要多個RT-qPCR實驗。在開始單細胞實驗之前，應當對細胞群體進行測定和分析。細胞群體測定將為您提供有用的信息，讓您清楚應使用哪些實驗條件，并對目的基因的表達水平有個大概了解。
因經費和時間限制，分析實驗條件和生物學重復通常是不可行的。對于*輪實驗，我們通常測定40-100個細胞中的10個基因，避免預擴增。這一數(shù)據(jù)將為您提供細胞異質性和關鍵標志物表達水平的信息。之后，設計更大的實驗就會比較輕松。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學院）
一定要包含可靠的對照實驗，以避免假陽性。在制備和開展實驗時要特別小心，避免RNA降解或逆轉錄條件不佳。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現(xiàn)在天津大學）
總的來說，下面三個步驟的效率對一個成功的單細胞分析很重要：細胞分離、RNA分離和cDNA合成、以及單細胞qPCR的引物設計。我們發(fā)現(xiàn)，適合高豐度模板的引物不一定適合單細胞水平的qPCR模板。
Q4：您采取哪些步驟來減少實驗誤差以及噪音？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
建立可重復的實驗步驟是非常重要的。例如，可將裂解液分成幾等份，單獨分析和比較，以檢驗裂解。利用CelluLyser，我們發(fā)現(xiàn)各等份之間的一致性很好，說明細胞均勻地裂解。利用加熱或蒸餾水來裂解細胞通常產生異質的裂解液，導致各等份不均一。通過RNA加標可檢測回收效率和重復性。我們設計了一個帶有5’帽子和A尾巴的通用加標，以模擬天然的mRNA。RNA加標可添加到裂解液中，或顯微注射到細胞中。逆轉錄也應當優(yōu)化。因引物結合、目的基因和逆轉錄酶的不同，RT產量可相差200倍之多。此外，添加到RT預混液中的裂解液的量也必須仔細調整，以避免抑制，同時讓RT產量zui高。預擴增同樣應該精心優(yōu)化和驗證。總的來說，重復性比避免偏向（bias）更關鍵，盡管這兩個參數(shù)通常是密切相關。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學）
所有實驗步驟都必須精心優(yōu)化。首先應確保您采集的細胞代表了群體，且有著良好的RNA質量。盡量減少不同實驗步驟之間的稀釋。這很重要，因為分子總數(shù)很少。不過，要避免加入過高濃度的去污劑、逆轉錄酶等，以免抑制下游實驗。逆轉錄、預擴增和qPCR都對抑制敏感。例如，逆轉錄酶可能抑制預擴增和qPCR。稀釋倍數(shù)取決于酶的選擇和品牌。如果只分析少數(shù)基因，應避免預擴增，以免此步驟引入更多偏向。運行技術重復可能收獲不大。相反，應盡可能地收集和分析更多細胞。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學院）
在制備和開展實驗時，必須一絲不茍。我們還用疏水物質包被玻璃移液管，以避免帶電荷的核酸吸附在玻璃上，這可能導致假陽性。記住，qPCR引物必須是zui高質量的，才能產生高質量的結果。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現(xiàn)在天津大學）
根據(jù)我們發(fā)表的結果，技術重復之間的誤差通常極小。然而，生物學重復之間的誤差就難以確定，因為無的對照存在。為了盡量減少單細胞之間的誤差，我們一般平行運行全部單細胞qPCR分析（包括RNA分離、cDNA合成和實時定量PCR），并在一塊PCR加熱板中（如ABI 48孔、96孔或384孔板）。
