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技術(shù)文章

30分鐘 超快速的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

閱讀:936發(fā)布時間:2013-3-6

說到甲基化分析,在我的印象中,QIAGEN是比較早推出相關(guān)產(chǎn)品的。它的EpiTect Bisulfite Kit可在6小時將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶*轉(zhuǎn)化成*,且手工操作極少。與傳統(tǒng)方法相比,算是一大進步。后來,其他廠家也陸陸續(xù)續(xù)推出了類似產(chǎn)品,速度越來越快。當然,QIAGEN也不甘落后,推出了新一代的產(chǎn)品。
EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit能夠在30分鐘內(nèi)非常地將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成*,且轉(zhuǎn)化率超過99%。而創(chuàng)新的DNA保護技術(shù)能確保的DNA變性,但不會降解,獲得高的DNA產(chǎn)量和重復的結(jié)果。此外,轉(zhuǎn)化后的DNA可在低至10 µl洗脫液中洗脫,產(chǎn)生高濃度的DNA。轉(zhuǎn)化后的DNA適合各種甲基化分析技術(shù),包括各種PCR、亞硫酸氫鹽測序、COBRA和焦磷酸測序等。
快速的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
試劑盒中的秘密就在于一種高濃度的亞硫酸氫鹽溶液,它能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化的時間從幾小時縮短至30分鐘。此外,亞硫酸氫鹽熱循環(huán)程序帶來了一系列經(jīng)過優(yōu)化的孵育步驟,以便開展DNA變性、磺化和胞嘧啶脫氨基,實現(xiàn)了超過99%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程的zui后一步,脫磺酸基,是在柱上輕松完成的。
DNA保護
在轉(zhuǎn)化過程中,我們通常還要面臨一個問題,那就是DNA的降解。因為亞硫酸氫鹽處理的劇烈條件,DNA會片段化,從而降低了PCR及后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。通常,亞硫酸氫鹽處理需要大量的起始DNA,以補償轉(zhuǎn)化過程中的DNA降解和純化過程中的DNA損失。而對于EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit,其*配方的DNA Protect Buffer可避免這種DNA段化。同時,它也實現(xiàn)了有效的DNA變性,產(chǎn)生了足夠的單鏈DNA。DNA Protect Buffer還包含了一種方便的pH指示劑染料,從而保證胞嘧啶轉(zhuǎn)化時正確的pH條件。
針對不同的起始樣品,這一產(chǎn)品線又具體分為三個產(chǎn)品:適用于基因組DNA的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、適用于FFPE樣品的EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kit以及適用于全血、細胞或組織的EpiTect Fast LyseAll Bisulfite Kit。它們的樣品制備有所不同,但之后所有樣品類型的DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化都是相同的。大致有以下幾步:亞硫酸氫鹽介導的未甲基化胞嘧啶的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后單鏈DNA與膜結(jié)合,洗滌,膜結(jié)合DNA的脫磺酸基,洗滌,轉(zhuǎn)化后DNA的洗脫。

EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kit還包含了將FFPE組織脫蠟和裂解所需的特殊緩沖液。從FFPE組織提取DNA時,不可避免地會發(fā)生DNA片段化,而亞硫酸氫鹽處理的劇烈條件通常會使情況更糟。而QIAGEN的DNA保護技術(shù)盡量減少這一過程中的片段化,讓DNA產(chǎn)量更佳。EpiTect Fast LyseAll Bisulfite Kit則通過一種創(chuàng)新的裂解緩沖液來處理全血、細胞或組織樣品。它可處理0.5-20 µl全血或10-105個細胞(低至60 pg DNA)。
此外,QIAGEN還推出了96孔板形式的快速轉(zhuǎn)化試劑盒——EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kit,實現(xiàn)了高通量的DNA轉(zhuǎn)化和純化。試劑盒也分為三種形式:普通、FFPE和LyseAll。


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