間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，（對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM），再經孵育洗滌后，加底物顯色，底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM，則可用于早期診斷。
1.實驗材料、試劑、儀器
血清 血漿 體液
PBS 包被緩沖液 硫酸 檸檬酸
96孔板 酶標比色計 移液槍 離心管 離心管盒
2.實驗步驟
一、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至zui適濃度（5～20 μg/ml）各0.3 ml加于微反應板每個凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時，貯存冰箱。
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
三、加被檢標本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0. 2ml，37℃，作用1～2小時。
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
五、加入酶結合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結合物0.2 ml 37℃作用1～2小時。
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
七、加入0.2 ml底物溶液于每個凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
八、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
九、觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492nm）OD值。
3.ELISA影響因素
一、 試驗樣品
血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關于人血清在保存過程中抗體的穩定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應曲線），然后用一個稀釋測定即可。zui適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的（即含抗體）作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現在對有些標本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。
二、 洗滌劑與稀釋劑
為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過量。但在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會從固相載體上被洗滌下來。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質很可能會吸附到原來包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產生假陽性反應,這是限制ELISA特異性的一個因素。因此不少學者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑來抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。已經證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫-20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫-20為0.05%。（有人曾經比較了四種洗滌劑，結果認為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP制備酶結合物時則不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結果觀察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。
有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利于加強封阻作用。zui近有人報告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩沖液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應，而且還可增加陽性標本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質有關。目前采用的洗滌劑為PH7.4PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應用。（0.5mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。
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