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小鼠巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)ELISA試劑盒價格

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更新時間:2016-04-22 18:39:47瀏覽次數:358次

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小鼠巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)ELISA試劑盒
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小鼠巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)ELISA試劑盒

 

 

卡邁舒(上海)生物科技酶聯免疫(elisa)法操作步驟:

1. 包被:用0.05M PH9,碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為110μgml,在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。

  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

  3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml,37℃孵育0.51小時,洗滌。

  4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml371030分鐘。

  5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

酶聯免疫(elisa)操作注意事項:

  1. 正式試驗時,應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應作一式二份,以保證實驗結果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應,可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

 

  2. 在ELISA中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

 

  (1) 固相載體的選擇:許多物質可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應,觀察其顯色反應是否均一性,據此判明其吸附性能是否良好。

 

 ?。?/span>2) 包被抗體或抗原的選擇:將抗體或抗原吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH9.09.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用41824小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.010μgml進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為110μgml

 

  (3) 酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定見酶標記抗體部份。然后再固定其它條件或采取“方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

 

(4)                     酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。有些供氫體OPD有潛在的致癌作用,應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMBABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。

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