本發明公開了種固定化氨基酰化酶的制備方法，其包含下列步驟：在水中，60-90℃下將固定化材料(卡拉膠和明膠)溶解，降溫至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均勻，然后將此混合液流加到溫度為20-35℃的有機溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KCl水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl水溶液中還含有戊二醛。本發明還公開了由其制得的固定化氨基酰化酶及其應用。本發明的制備方法可有效降低固定化材料的凝固點，并且制得的固定化氨基酰化酶是顆粒狀，流動性好，可以方便的拆分光學活性氨基酸。