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磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞2012/07/27
磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞一.試劑配制無(wú)菌水ddw：高溫滅菌；分裝；2XHBS：280mMNaCl10mMKCl1.5mMNa2HPO412mMglucose50mMHEPESAdjustthepH,every0.05pHfrom7.00to7.45using10NNaOH,thenaddddw.tothefinalvolume.過(guò)濾滅菌，分裝；2MCaCl2：過(guò)濾滅菌，分裝。二.實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1.鋪細(xì)胞：選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代，2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mmdish。2.20-24h后
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)2012/07/26
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)材料：6孔板marker筆直尺20微升槍頭（滅菌）無(wú)血清培養(yǎng)基PBS準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min（超凈臺(tái)內(nèi)）流程：1、先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃?rùn)M線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。2、在空中加入約5X105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過(guò)夜能鋪滿。3、第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不要傾斜。4、用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培
大鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)2012/07/19
大鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)1材料1.1動(dòng)物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。1.2試劑PBS、培養(yǎng)液（低糖DMEM，新生牛血清、青*、1%明膠,PBS、0.25%*），碘酒和酒精綿球。1.3手術(shù)器械眼科直剪2把、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套，25cm2塑料培養(yǎng)瓶（Costar）。2方法2.1明膠包被培養(yǎng)瓶過(guò)夜（準(zhǔn)備2-3個(gè)），取出明膠，用2ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍，置于超凈臺(tái)中。2.2解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)上的玻璃培養(yǎng)皿中，用碘酒消毒胸部皮膚，再
熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡2012/07/16
熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡一、儀器與試劑1.TdT酶（25U/μl）；2.*標(biāo)記的-dUTP（Biotin-dUTP）或地高辛標(biāo)記的dUTP（Digoxingening-11-dUTP）1nmol/μl；3.反應(yīng)緩沖液；4.洗滌緩沖液；5.異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素（2.5μg/ml）或抗地高辛抗體（1:30）；6.PI染液（含PI5μg/ml及0.1%無(wú)DNA酶活性的RNA酶）；7.PBS緩沖液；8.塑料蓋玻片；9.貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞；10.懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片；冰
原代細(xì)胞傳代技術(shù)2012/06/19
原代細(xì)胞傳代技術(shù)一、貼壁細(xì)胞的消化法傳代1、吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。2、加入1ml左右消化液（*或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。3、消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)，棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。二、懸浮細(xì)胞的傳代1、直接傳代①讓?xiě)腋〖?xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3。②用吸管吹打形
293-T細(xì)胞培養(yǎng)2012/06/14
293-T細(xì)胞培養(yǎng)293-T細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：1.用1640加10%胎牛血清，有的種系用DMEM.血清要求質(zhì)量較高，在普通血清中細(xì)胞生長(zhǎng)不太好。1640用雙蒸水溶解，按說(shuō)明加入*。2.培養(yǎng)液中應(yīng)加入HEPES，起緩沖pH值的作用，否則會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。如果用20%的HEPES，每次配培養(yǎng)液時(shí)每200ml培養(yǎng)液可加入5ml.加入HEPES后1640培養(yǎng)液顏色略呈橘黃色而非暗紅色。3.消化所用*可選擇0.125%濃度，且不要消化時(shí)間太長(zhǎng)。也有研究者認(rèn)為不用*，直接吹打使細(xì)胞脫壁，但使用*效果
細(xì)胞 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選2012/06/13
細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選1．確定抗生素作用的*濃度：不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn)，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的zui低作用濃度。①提前24小時(shí)在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔，接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。②將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增0,（50,100,200,400,600,800和1000μg/ml）。③培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml，篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃
人γ干擾素ELISA試劑盒 簡(jiǎn)易操作說(shuō)明2012/06/11
人γ干擾素ELISA試劑盒簡(jiǎn)易操作說(shuō)明人γ干擾素ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人γ干擾素（IFN-γ）水平。用純化的人γ干擾素（IFN-γ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入γ干擾素（IFN-γ），再與HRP標(biāo)記的γ干擾素（IFN-γ）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的γ干擾素（IFN-γ）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光
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