?乳酸脫氫酶(LDH)活性微量法測定的原理?是通過檢測LDH催化丙酮酸還原為乳酸的過程中NADH的生成量來間接測定LDH的活性。
具體過程如下:
?反應(yīng)原理?:在LDH的作用下,NAD+被還原生成NADH。NADH與WST-8相互作用產(chǎn)生顏色,從而進(jìn)行比色測定(λmax=450 nm)?。
?反應(yīng)條件?:LDH將NAD還原為NADH,NADH與WST-8相互作用產(chǎn)生顏色。這個反應(yīng)在冰上避光進(jìn)行,各組分(如Assay Buffer、Lactate、NAD、WST-8、Enhancer)需在實驗前從冰箱中取出并平衡至室溫,整個過程需避光操作?。
?吸光度測量?:在450 nm波長下測量吸光度,吸光度與LDH活性成正比,可以通過比色法測定LDH的活性?。
?實驗步驟和所需設(shè)備?:
?實驗步驟?:準(zhǔn)備工作液(1×Assay Buffer、NAD、WST-8、Enhancer和Lactate混合均勻),將工作液加入96孔板或微量玻璃比色皿中,加入待測樣品,37℃恒溫孵育一定時間后測量吸光度?。
?所需設(shè)備?:酶標(biāo)儀或可見分光光度計(能測450 nm處的吸光度)、恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)、96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、去離子水、勻漿器(如果是組織樣本)?。
實驗注意事項?:
?試劑保存?:各組分(如Assay Buffer、Lactate、NAD、WST-8、Enhancer)需在冰上避光保存,避免反復(fù)凍融?。
?操作注意事項?:整個實驗過程需在冰上避光進(jìn)行,避免光照影響結(jié)果?。