類器官jinpai基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過基因編輯技術(shù)將多種表達(dá)膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細(xì)胞體系中，并在實體中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白。基底膜基質(zhì)也含有轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和在中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

推薦應(yīng)用

此款基質(zhì)膠是篩選出的確保能進行類器官培養(yǎng)的基質(zhì)膠。如果遇到不能用其他類型的基質(zhì)膠培養(yǎng)的類器官，使用該系列基質(zhì)膠可以保證實驗的有效性和重現(xiàn)性。例如，小鼠腸道類器官、肺類器官、類器官等。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品參數(shù)

來源：小鼠

外觀：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為黃色-粉紅色，無酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內(nèi)毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時成膠速度加快

2D/3D應(yīng)用非常廣泛：干細(xì)胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細(xì)胞培養(yǎng)（類器官、3D細(xì)胞球）、體內(nèi)植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規(guī)范

• 通過小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進行常規(guī)小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細(xì)胞

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴(yán)格控制

• 對細(xì)菌、真菌和支原體進行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內(nèi)毒素水平

• 在37℃下進行14天的凝膠穩(wěn)定性測試

• 每批次產(chǎn)品進行生物學(xué)功能驗證（類器官培養(yǎng)與分化實驗；皮下實驗；干細(xì)胞培養(yǎng)；血管生成實驗等）

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴(yán)格控制

使用注意事項

實驗環(huán)境

• 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

• 請穿戴個人防護裝置，注意實驗室安全。

溫度控制

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。在-20℃冰箱中儲存分裝物直到準(zhǔn)備使用。請不要儲存在無霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因為模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 在10℃以上會開始凝膠化。所以需謹(jǐn)記：模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 和所有與模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 接觸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基都應(yīng)該預(yù)冷。在實驗的全部過程中請務(wù)必保持模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實驗操作人員需嚴(yán)格區(qū)分實驗操作臺、清潔區(qū)和污染區(qū)，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動作呈單向流動。

• 實驗后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實驗操作區(qū)消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過夜解凍模基生物基質(zhì)膠，蛋白濃度高時可能需要更多時間。請將模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 全程保持在冰上。無論是開蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進行分裝，請保持無菌操作。

• 操作過程中，需使用預(yù)冷的移液管輕柔地吹打混勻模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 以確保其均勻性。將模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 分裝到離心管中，每當(dāng)模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個小時，凝膠化的模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠 可能會被重新水化。

操作說明

分裝操作說明

基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。以下為實驗操作者進行分裝操作說明。

1.將基質(zhì)膠置于預(yù)冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過夜解凍。

2.將無菌離心管、無菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預(yù)冷盒中或冰箱中預(yù)冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預(yù)冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據(jù)每次用量多少進行分裝)，標(biāo)注好信息，操作過程中盡量保持低溫，縮短操作時間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩Ｕ埐灰獌Υ嬖谧詣映谋渲袃Υ妗Ｊ褂们皩⒒|(zhì)膠插入預(yù)冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩(wěn)定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說明

包被涂層方法  

模基生物類器官jinpai基質(zhì)膠可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細(xì)胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復(fù)雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養(yǎng)細(xì)胞。您的選擇基于您想要實現(xiàn)的最終結(jié)果，無論是細(xì)胞生長、附著還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍模基生物基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長表面加入模基生物 基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話，請在使用無血清培養(yǎng)基輕柔漂洗前吸出未結(jié)合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍模基生物基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無血清培養(yǎng)基將模基生物基底膜基質(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實驗應(yīng)用，您應(yīng)該完成以經(jīng)驗為主的研究來確定您的zuishi包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的模基生物 基底膜基質(zhì)。加入的量應(yīng)該足以容易地覆蓋整個生長表面。在室溫下培養(yǎng) 1 個小時。

4.吸出未結(jié)合的材料并使用無血清培養(yǎng)基輕柔地漂洗。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍模基生物基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上。向模基生物基底膜基質(zhì)中加入細(xì)胞并使用預(yù)冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長表面加入模基生物 基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在37℃，30分鐘。現(xiàn)在可以添加培養(yǎng)基了。細(xì)胞也可以培養(yǎng)在這一凝膠的頂部。

細(xì)胞復(fù)蘇：

使用細(xì)胞復(fù)蘇溶液在冰上 7 小時內(nèi)解聚模基生物基底膜基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)將生長在模基生物基底膜基質(zhì)上的細(xì)胞zuiyouxiao地復(fù)蘇，或者使用zhongxingdanbaimei，考慮到連續(xù)培養(yǎng)，zhongxingdanbaimei作為一種金屬酶可以分散細(xì)胞。

應(yīng)用操作說明

以下以小鼠小腸類器官原代建立實驗為例來進行模基生物類器官金牌基質(zhì)膠的應(yīng)用實驗操作說明。

一、實驗?zāi)康?/strong>

1.1熟練掌握小鼠小腸類器官原代建立技術(shù)。

1.2了解掌握小鼠多種組織來源類器官原代建立技術(shù)。

1.3觀察記錄小鼠小腸原代類器官生長、擴增過程中類器官形態(tài)的變化。

二、實驗原理

本實驗策略采取從成體干細(xì)胞中建立和維持小鼠小腸類器官的方法。小鼠小腸類器官主要由干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

三、實驗儀器、材料、試劑

1、儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱、搖床

2、材料：細(xì)胞培養(yǎng)板（規(guī)格為 24 孔、48 孔和 96 孔）、離心管（規(guī)格為 1.5 mL、15 mL 和 50 mL）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑規(guī)格為 2.5 cm、6 cm和10 cm）、移液器（規(guī)格為 2.5 μL、10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL 和 5000 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、無菌鑷子、無菌zuzhijian、70μm細(xì)胞過濾器、shoushudao片

3、實驗試劑：小鼠小腸類器官培養(yǎng)試劑盒、EDTA (0.5M, pH 8.0) 、潤洗液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基質(zhì)膠、DPBS

四、實驗內(nèi)容與方法

4.1 實驗前準(zhǔn)備：

? 小鼠小腸類器官培養(yǎng)試劑盒、基質(zhì)膠4℃化凍

? 小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基。 室溫平衡，可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。

? 準(zhǔn)備足量添加1%雙抗的DPBS

? 準(zhǔn)備足量添加0.1%BSA的DPBS

? 配制5mM EDTA溶液：4mL預(yù)冷DPBS溶液加40μL 0.5M EDTA溶液pH8.0，置冰上備用。

4.2 取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近胃端3~10cm腸組織，用鑷子去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含雙抗的DPBS溶液中。

4.3 清洗：使用shoushujian將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用shoushudao片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗2次。 將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用DPBS清洗2遍。

4.4 消化：將清洗好的腸段轉(zhuǎn)移至含有5mmol/L EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，置于4℃孵育20~30min，消化20分鐘可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現(xiàn)完整隱窩即可終止消化，若無隱窩可適當(dāng)延長消化時間。

4.5 清洗：消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)2次以去除 EDTA。

4.6 重懸：用 5mL 移液管在預(yù)冷的0.1%BSA的DPBS的培養(yǎng)皿或 50mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進行70μm濾網(wǎng)過濾。

4.7 收集：收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，300g 離心力 4℃離心3min。

4.8 計數(shù)：棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μL 懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g 離心力 4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

4.9 用適量的Matrigengel Matrix重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL Matrigengel Matrix懸液包含70至100個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免Matrigengel Matrix過早凝固。

注意： Matrigengel Matrix稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigengel Matrix的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

4.10 將  Matrigengel Matrix和組織細(xì)胞的混合懸液點入24孔板底部正zhongyang，每孔 30μL 左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止 Matrigengel Matrix室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

4.11 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待 Matrigengel Matrix 凝固。

待 Matrigengel Matrixwanquan凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠小腸類器官wanquan培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

4.12將24孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.13每3天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞 Matrigengel Matrix。

4.14密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應(yīng)在5至7天內(nèi)建成。